Isolement des astrocytes : une méthode pour obtenir une préparation pure d’astrocytes corticaux de souris

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Isolement et placage de cellules corticales mixtes

L’isolement de cellules corticales mixtes pour les cultures d’astrocytes peut être effectué à l’aide de petits souris P1 à P4. Afin d’obtenir une densité astrocytaire appropriée, il est nécessaire d’utiliser 4 cortex de petits de souris par flacon de culture tissulaire T75. Par conséquent, les volumes dans le protocole suivant sont calculés pour une préparation cellulaire à l’aide de 4 petits souris.

1. Avant de commencer la procédure de dissection, préchauffer 30 mL de milieu de culture d’astrocytes (DMEM, glucose élevé + 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur + 1 % de pénicilline/streptomycine ; voir tableau) à 37 °C. Enduire un flacon T75 de 20 mL de poly-D-lysine (PDL) à une concentration de 50 μg/mL dans de l’eau de culture cellulaire pendant 1 heure à 37 °C dans l’incubateur de CO₂.
2. Pour la procédure de dissection, préparez tous les réactifs et matériaux nécessaires. Vous aurez besoin de ciseaux chirurgicaux, de pinces fines lisses, de pinces à bout plat, d’essuie-tout, d’un sac à déchets, d’éthanol à 70 % et de 2 plats de dissection (3,5 cm de diamètre) sur de la glace remplis de 2 ml de HBSS chacun.
3. Tenez doucement et vaporisez la tête et le cou du bébé souris avec de l’éthanol à 70 %. L’animal est sacrifié par décapitation à l’aide de ciseaux.
4. Effectuez une incision médiane, postérieure à antérieure, le long du cuir chevelu pour révéler le crâne.
5. Coupez soigneusement le crâne du cou au nez. Deux coupes supplémentaires sont effectuées pour permettre un accès plus poussé au cerveau : la première coupe est faite en avant des bulbes olfactifs, l’autre en dessous du cervelet pour déconnecter le crâne de la base du crâne.
6. À l’aide de la pince à bout plat, les volets crâniens sont doucement retournés sur le côté et le cerveau est retiré et placé dans la première boîte de dissection remplie de HBSS. Remettez le plat sur de la glace et continuez à récolter les 4 cerveaux.
7. Le reste de la procédure de dissection est effectué au stéréomicroscope. Tout d’abord, les bulbes olfactifs et le cervelet sont retirés à l’aide de la pince à dissection fine (Figure 1B).
8. Afin de récupérer les cortex, saisissez l’extrémité postérieure du cerveau avec la pince fine, effectuez une incision médiane entre les hémisphères, insérez une deuxième série de pinces dans le bosquet créé et retirez la structure en forme de plaque du cortex du cerveau.
9. Disséquez soigneusement les méninges des hémisphères du cortex en tirant avec la pince fine (Figure 1D'). Cette étape permet d’éviter la contamination de la culture finale d’astrocytes par les cellules méningées et les fibroblastes. Transférez les hémisphères du cortex préparés dans le deuxième plat rempli de HBSS et remettez-le sur de la glace. Continuez en conséquence avec les 4 cortex.
10. Enfin, coupez chaque hémisphère du cortex en petits morceaux à l’aide de lames tranchantes (environ 4 à 8 fois).
11. Dans des conditions stériles, transférez des morceaux de cortex dans un tube Falcon de 50 ml et ajoutez HBSS à un volume total de 22,5 ml.
12. Ajouter 2,5 mL de trypsine à 2,5 %, mélanger et incuber le tissu dans le bain-marie à 37 °C pendant 30 min. Mélanger en secouant de temps en temps toutes les 10 min.
13. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g pour granuler les morceaux de tissu du cortex
.
14. Éliminer soigneusement le surnageant par décantation. Afin d’éviter de perdre la pastille de tissu, vous pouvez la retenir mécaniquement à l’aide d’une pipette. Dissociez le tissu en une suspension unicellulaire en ajoutant 10 ml de milieu de placage d’astrocytes et un pipetage vigoureux à l’aide d’une pipette en plastique de 10 ml jusqu’à ce que les morceaux de tissu soient dissociés en cellules uniques (20 à 30 fois). Ajuster le volume à 20 mL à l’aide d’un milieu de placage d’astrocytes. Vous pouvez prouver la dissociation du tissu cortical en cellules uniques en comptant à l’aide d’un hématocytomètre. Une préparation de 4 cortex de petits de souris devrait produire 10 à 15 x10⁶ cellules uniques dissociées.
15. Aspirer la PDL de la fiole de culture T75, mettre en plaque la suspension unicellulaire dissociée et incuber à 37 °C dans l’incubateur de CO₂.

2. Obtention d’une culture d’astrocytes enrichie

1. Changez le milieu 2 jours après le placage des cellules corticales mixtes et tous les 3 jours suivants.
2. Après 7 à 8 jours, lorsque les astrocytes sont confluents et que les microglies superposées sont exposées sur la couche d’astrocytes ou sont déjà détachées de la couche d’astrocytes (Figure 2), agitez la fiole T75 à 180 tr/min pendant 30 min sur un agitateur orbital pour éliminer la microglie. Jetez le surnageant contenant la microglie ou, si vous souhaitez cultiver et examiner la microglie, faites-le tourner vers le bas et plaquez-le pour la culture.
3. Ajouter 20 mL de milieu de culture d’astrocytes frais et continuer en agitant le ballon à 240 tr/min pendant 6 heures pour éliminer les cellules précurseurs d’oligodendrocytes (CPO). Étant donné que certains OPC ne se détachent pas complètement de la couche d’astrocytes, continuez à agiter vigoureusement à la main pendant 1 min afin d’éviter la contamination des OPC. Jetez le surnageant ou faites-le tourner et plaquez-le, si vous souhaitez cultiver des OPC.
4. Rincez deux fois la couche d’astrocytes confluente restante avec du PBS, aspirez le PBS, ajoutez 5 ml de trypsine-EDTA et incubez dans l’incubateur de CO₂ à 37 °C. Vérifiez le détachement des astrocytes toutes les 5 minutes et imposez le détachement des astrocytes en frappant le flacon contre la paume de votre main (2 à 3 fois).
5. Une fois les astrocytes détachés de la fiole de culture, ajouter 5 mL de milieu de culture d’astrocytes, faire tourner les cellules à 180 x g pendant 5 min, aspirer le surnageant et ajouter 40 mL de milieu de placage d’astrocytes frais. Une fiole de culture tissulaire T75 devrait produire environ 1x10⁶ cellules après la première division cellulaire. Plaquez les cellules dans deux flacons de culture T75 et incubez à 37 °C dans l’incubateur de CO₂. Changez de milieu tous les 2 à 3 jours.
6. 12 à 14 jours après que les premiers astrocytes divisés sont placés dans la concentration cellulaire appropriée, 24 à 48 heures avant la réalisation de l’expérience. Une fiole de culture tissulaire T75 devrait produire environ 1,5 à 2 x 10⁶ cellules après la deuxième division cellulaire.

Graphique 1. Dissection du cortex postnatal (P3) de la souris. A) Cerveau entier. B) Cerveau après l’ablation des bulbes olfactifs et du cervelet. C) Isolement des cortex en décollant de la structure en forme de plaque du cortex du cerveau. D, D') Cortex des sites ventral et dorsal avec méninges (les flèches noires indiquent les artères méningées). E) Cortex sans méninges. Barre d’échelle, 1,5 mm.

Graphique 2. Vue morphologique des cellules corticales mixtes isolées et culture d’astrocytes purs à différents moments après isolement. A) 1 jour après le placage des cellules corticales mixtes. Les premiers astrocytes sont attachés au fond du ballon (flèches noires) et les neurones mourants sont dans le surnageant. B) 3 jours après le placage des cellules corticales mixtes. Une couche d’astrocytes se forme (flèches noires). Les neurones sont presque absents. C) 5 jours après le placage des cellules corticales mixtes. D’abord une microglie et des OPC au-dessus d’une couche d’astrocytes (flèches noires). D) 7 jours après le placage des cellules corticales mixtes. La couche d’astrocytes est complètement confluente. E) Après l’élimination de la microglie et des OPC par une agitation vigoureuse et 2 jours après la séparation, les cellules attachées présentent une morphologie astrocytaire de faible densité (les flèches indiquent une cellule). F) La couche d’astrocytes présente une densité élevée 2 semaines après la première division. Barre d’échelle, 10 μm.