Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement des microvaisseaux cérébraux du rat
- Pour chaque préparation et pour un expérimentateur, utilisez 3 rats Wistar âgés de cinq semaines.
- Le lundi de la première semaine, préparer 2 flacons T75 en les enrobant de collagène de type IV et de fibronectine, tous deux à 1 μg/cm2 dans de l’eau de culture stérile (10 ml par T75). Laisser adhérer à 37 °C jusqu’à l’ensemencement des microrécipients.
- Le mercredi matin de la première semaine, euthanasiez les rats sous un flux croissant de CO2 pour induire la somnolence, la perte de posture et l’interruption de la respiration, suivie d’une luxation cervicale. Vaporisez les têtes avec de l’éthanol à 70 %. Coupez les têtes avec une paire de ciseaux et transférez-les dans une boîte de Pétri sèche sous une hotte à flux laminaire.
- Retirez les cerveaux du crâne sans le cervelet et les nerfs optiques, puis transférez-les dans une boîte de Pétri refroidie sur de la glace et remplie d’un tampon de dissection à froid (HBSS complété par 1 % de BSA, pénicilline 100 unités/ml et streptomycine 100 μg/ml).
- Coupez le cerveau en deux pour séparer les 2 hémisphères cérébraux et séparer le mésencéphale du cerveau antérieur. Transférez les cerveaux antérieurs dans une boîte de Pétri propre sur de la glace avec un tampon de dissection.
- Prenez quelques hémisphères dans une nouvelle boîte de Pétri avec tampon de dissection à froid pour retirer soigneusement les méninges du cerveau antérieur sous un stéréomicroscope avec N° 5 pinces incurvées. Ensuite, nettoyez l’intérieur du cerveau pour enlever la couette de myéline et obtenir une coquille de cortex. Ces étapes ne devraient pas prendre plus de 2 heures pour la préservation des tissus et la survie cellulaire.
- Dissociez le cortex de 3 cerveaux dans 6 mL de tampon de dissection à froid dans un homogénéisateur de 7 mL par 10 mouvements de haut en bas avec chacun des 2 pilons de dégagements différents, 71 μm suivis de 20 μm.
- Divisez la suspension pour obtenir l’équivalent de 1 cortex dans 1 mL d’un tube Falcon de 50 mL et centrifugez à 1 000 x g pendant 5 min à RT. Jetez le surnageant.
- Digérer la suspension de 1 cortex avec 1 mL d’une solution enzymatique contenant un mélange de collagénases/dispase (60 μg/mL–0,3 U/mL), de DNase de type I (35 μg/mL–20 unités K/mL) et de gentamicine (50 μg/mL) dans un agitateur pendant 30 min à 37 °C.
- Mélanger la digestion de 1 mL de 1 cortex avec 10 mL de BSA/HBSS 1X à 25 % et séparer par centrifugation dépendante de la densité à 3 600 x g pendant 15 min à RT. Transvaser soigneusement le disque supérieur (myéline et parenchyme cérébral) et le surnageant dans un tube Falcon propre de 50 mL et répéter la centrifugation. Maintenez la pastille résultante contenant les microvaisseaux cérébraux à 4 °C.
- Jetez soigneusement le disque supérieur et le surnageant. Remettez en suspension les deux pastilles résultantes contenant les microvaisseaux cérébraux avec 1 mL de HBSS 1X froid et transférez-les dans un tube Falcon propre de 50 mL.
- Lavez les microrécipients en ajoutant 20 mL de HBSS 1X froid et centrifugez-les à 1 000 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
- De plus, digérer les microvaisseaux d’un cortex avec 1 mL de la même solution enzymatique que celle décrite à l’étape 1.9 pendant 1 heure à 37 °C dans un agitateur.
- Ensuite, mélangez les microvaisseaux digérés de chacun des 3 cortex dans un tube et séparez-les ensuite dans deux tubes Falcon de 50 ml pour obtenir des microvaisseaux extraits de l’équivalent d’un cortex et demi (1,5) par tube. Ajouter 30 mL de tampon de dissection à froid et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à RT.
- Remettre en suspension la pastille de microvaisseaux dans 10 mL de DMEM/F12 complété par 20 % de sérum dérivé du plasma plaquettaire bovin, du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF, 2 ng/mL), de l’héparine (100 μg/mL), de la gentamicine (50 μg/mL) et de HEPES (2,5 mM), appelés milieux de cellules endothéliales (ECM) complétés par de la puromycine à raison de 4 μg/mL.
- Prélever les 2 flacons T75 enrobés de l’incubateur, aspirer l’excédent de revêtement et déposer les microvaisseaux de chaque tube dans un ballon T75 (microvaisseaux extraits de 1,5 cortex par ballon T75).
