Modèle de barrière tumorale hémato-encéphalique ou BBTB : une adaptation du modèle de barrière hémato-encéphalique ou BHE pour évaluer l’administration de traitements à la tumeur

Résumé

Source : Le Joncour, V. et al. Prédire l’administration de charges utiles in vivo à l’aide d’une barrière tumorale hémato-encéphalique dans une parabole. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole complet pour établir un modèle in vitro imitant la barrière tumorale hémato-encéphalique. Le modèle est prometteur pour comprendre l’administration d’agents thérapeutiques pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Mise en place des BBTB Mimics

REMARQUE : Le milieu de culture cellulaire et les suppléments sont détaillés dans la Table des matériaux.

1. Préparation des astrocytes
   note: Les volumes suivants conviennent à une boîte de Pétri de 10 cm ou à une fiole de culture cellulaire T75.
   1. Sous une hotte de culture cellulaire stérile, laver soigneusement les astrocytes cultivés avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile. Jetez délicatement le PBS à l’aide d’une pompe à vide et ajoutez 2 mL de réactif de dissociation cellulaire pendant 5 min (à 37 °C, voir le tableau des matériaux) pour détacher les cellules. Vérifiez le détachement de la cellule au microscope. Ne pas dépasser 5 min d’incubation pour limiter le stress sur les cellules.
   2. Ajouter 10 ml de milieu de culture cellulaire complet d’astrocytes stérile (ABM+) dans le récipient pour inhiber l’activité du réactif de dissociation cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, transférez les cellules détachées du récipient dans un tube stérile de 15 ml. Centrifuger la suspension de la cellule pendant 3 min à 250 rcf (accélération : 9 rcf/s, décélération : 5 rcf/s) à température ambiante (RT).
   3. Pendant ce temps, préparez les inserts (voir le tableau des matériaux) : à l’aide d’une pince stérile, placez les inserts avec le côté cerveau vers le haut (Figure 1A) sur le couvercle d’une plaque stérile à 6 puits (Figure 1B). Vérifiez au préalable que la plaque peut être placée à l’envers sur les inserts sans toucher ou déplacer les inserts pendant le processus.
      REMARQUE : Le bon placement des inserts permet de piéger la suspension d’astrocytes entre la membrane et le fond du puits.
   4. Une fois centrifugé, jeter soigneusement le surnageant de la suspension cellulaire ; remettre en suspension la pastille d'astrocytes dans 1 mL d'ABM+ en remettant doucement la pastille en suspension sur la paroi du tube jusqu'à 5x. Éviter un pipetage excessif des cellules pour limiter le stress sur les cellules. Comptez les cellules et ajustez la densité de suspension cellulaire à 1,5 x 10⁵ cellules dans 400 μL d’ABM+/insert.
   5. Placez la suspension cellulaire au milieu du côté cerveau de la membrane de l'insert (Figure 1B) et, très soigneusement, étalez-la en utilisant la force capillaire avec une pointe de pipette stérile. Évitez le contact direct car la membrane est particulièrement fragile.
   6. Avec le côté cerveau des inserts toujours vers le haut, replacez la plaque à 6 puits sur les inserts. Cela permet de s’assurer que la suspension cellulaire est piégée entre la membrane et le fond même du puits (figure 1C). Évitez les bulles d’air dans la suspension cellulaire, car cela empêchera la propagation homogène des astrocytes sur la membrane.
   7. Placez la plaque et les inserts, côté cerveau vers le haut, dans l’incubateur (à 37 °C avec 5 % de CO₂) pour permettre l’adhésion cellulaire pendant un minimum de 2 h (astrocytes murins immortalisés) et jusqu’à 6 h (astrocytes primaires humains).
      REMARQUE : Comme les inserts sont maintenus à l’envers, la visualisation de l’adhésion cellulaire n’est pas possible au microscope. Il est donc recommandé d’ensemencer un récipient de culture cellulaire régulier séparé et de contrôler l’adhésion cellulaire dans le récipient au fil du temps. Une manipulation soigneuse de la membrane est indispensable car les résultats ne seront pas fiables lorsque les membranes sont endommagées.
   8. À la fin du temps d’incubation, vérifiez l’absence de fuites de suspension cellulaire à l’extérieur de la zone d’ensemencement et jetez les inserts s’ils fuient. Remettez la plaque à 6 puits dans sa position normale, avec des inserts qui auront maintenant le côté sang vers le haut (Figure 1A). Ajouter 2,6 mL d’ABM+ dans chaque puits. Versez 2,5 mL de milieu astrocytaire complet dans chaque insert et placez la plaque dans l’incubateur (à 37 °C avec 5 % de CO₂).

2. Préparation des cellules endothéliales

REMARQUE : Pour les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales murines (bEND3), les cellules doivent atteindre une confluence de 100 % pour assurer des contacts cellule-cellule maximaux déclenchant l’expression optimale de la protéine de jonction serrée le jour de l’expérience. Cela ne s’applique pas aux cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HuAR2T) car la présence d’astrocytes est nécessaire à l’expression d’une protéine de jonction serrée pour ces cellules.

1. Procédez comme décrit précédemment pour les astrocytes pour la dissociation cellulaire. Une fois centrifugé, jeter soigneusement le surnageant ; remettre en suspension la pastille de cellules endothéliales dans 1 mL de milieu de culture de cellules endothéliales complet (EBM+) en pipetant lentement la suspension cellulaire sur la paroi du tube jusqu'à 5x. Évitez le pipetage excessif des cellules pour limiter le stress sur les cellules. Compter les cellules et ajuster la densité de suspension cellulaire à 2 x 10⁵ cellules dans 2,5 mL/insert de milieu de culture cellulaire endothéliale dépourvu de sérum (EBM-) et de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-A (VEGF-A).
2. Sortez la plaque contenant les inserts, jetez soigneusement le milieu du côté du sang et remplacez-le par 2,5 ml de suspension de cellules endothéliales. Remettez la plaque dans l’incubateur (à 37 °C avec 5 % de CO₂) et laissez-la reposer toute la nuit pour que les cellules endothéliales adhèrent à la membrane.
3. Le lendemain, préparez une plaque stérile à 6 puits en transférant 3 ml de milieu astrocytaire sans sérum (ABM-) préchauffé dans chaque puits. En manipulant les inserts à l’aide d’une pince stérile, jetez soigneusement le milieu endothélial complet du côté du sang, placez l’insert dans la nouvelle plaque contenant ABM- et ajoutez 2,5 mL d’EBM-.
   note: L’utilisation de l’EBM- est essentielle pour l’établissement de la barrière endothéliale.
4. Laissez les inserts dans l’incubateur (à 37 °C avec 5 % de CO₂) avec un minimum de perturbations physiques et de variations de température pendant 5 jours, permettant la production de la membrane basale endothéliale, les contacts des astrocytes avec les cellules endothéliales et, éventuellement, la formation de la BHE mimique. Remplacer le milieu le jour du transfert sur les cultures de cellules de gliome.

3. Préparation des cellules de gliome

REMARQUE : Bien que des sphères de glioblastome dérivées de patients soient utilisées ici, le protocole suivant peut être facilement adapté aux cellules de glioblastome adhérentes et disponibles dans le commerce, telles que U-87MG.

1. En option, pour l’imagerie par immunofluorescence, placez jusqu’à quatre lamelles rondes stériles en borosilicate (ø 0,9 cm) par puits dans une plaque à 6 puits contenant 2 mL de poly-D-lysine (0,01 %). Incuber à température ambiante pendant 30 min.
2. Pendant ce temps, transférez soigneusement les sphères tumorales du récipient de culture cellulaire dans un tube stérile de 15 ml à l’aide d’une pipette sérologique stérile. Centrifuger les sphères tumorales pendant 3 min à 250 rcf.
3. Jetez le surnageant, remettez doucement les sphères en suspension dans 1 mL de milieu cellulaire de gliome exempt de bFGF/EGF (GBM-) et comptez les cellules. Ajustez la densité cellulaire à environ 10⁴ sphères/mL (10⁵ cellules/mL) en GBM-.
4. Jetez la poly-D-lysine des puits et rincez-les 3 fois avec du PBS stérile. Ensemencez la plaque avec 3 mL/puits de suspension de sphéroïde tumoral et transférez les inserts avec l’imitation de la BHE sur la suspension de cellules tumorales.
5. Incuber pendant la nuit (à 37 °C avec 5 % de CO₂) pour permettre l’équilibre entre le sang et les côtés de la tumeur cérébrale du test. Le lendemain, remplacez le milieu du côté sanguin par de l’EBM complété par les molécules/médicaments/nanoparticules d’intérêt. Les échantillons sont prélevés au fil du temps pour une quantification directe, comme décrit dans la section précédente. Les cellules sont fixées à un point précis pour l’imagerie par fluorescence.

Résultats

Figure 1 : Description du modèle de barrière tumorale hémato-encéphalique (BBTB).(A) Représentation schématique de l’emplacement des différents types de cellules. (B) Illustration de l’emplacement de l’insert sur le couvercle de la plaque à 6 puits et de la technique d’ensemencement des astrocytes du côté cerveau de la membrane de l’insert. (C) Illustration du placement de la pla...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules
bEND3	ATCC	CRL-2299	Culture dans : DMEM (1 g/L de glucose) complété par 10 % de FBS - 5 mL de L-glutamine et 5 mL de pénicilline/streptomycine
HIFko a immortalisé les astrocytes de souris	Isolé dans le laboratoire du Dr Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Culture dans : BME-1 supplémenté avec 5 % de FBS - 5 mL 1 M HEPES-5 mL 100 mM de pyruvate de sodium - 3 g de D-glucose et 5 mL de pénicilline/streptomycine
HuAR2T	Isolé dans le laboratoire de la Dre Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Cultivé en : EBM-2 avec SupplementMix astrocytes primaires humains normaux Lonza CC-2565 Cultivé en : ABM avec SingleQuots
Matériel et réactifs
100 mm x17 mm Plat Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	Référence 150350
Pipette sérologique de 10 mL	ThermoFisher Scientific	170361
Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 15 mL	ThermoFisher Scientific	Référence 339650
ABM Basal Moyen 500 mL	Lonza	CC-3187	Pour les astrocytes humains primaires. ABM+ : contient tous les additifs du mélange de suppléments. ABM- :tous les additifs sauf rhEGF et FBS
Solution de détachement de cellules d’accutase	Corning	Référence 25-058-CI
AGM SingleQuots Suppléments et facteurs de croissance	Lonza	CC-4123
Supplément B27	Gibco	Référence 17504-044	Pour GBM + et - moyen
Aigle moyen basal	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Plaques 6 puits traitées Corning Costar TC	Sigma-Aldrich	CLS3506
Inserts de culture cellulaire à membrane polyester Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-glucose	Sigma-Aldrich	Référence G8270	Dissoudre dans 50 mL de BME-1 et de filtre stérile avant de l’ajouter au milieu
Jambon F-12 Eagle's Modified Eagle's Medium/Nutrient	Gibco	Référence 21331-020	Spécifique à la culture des sphères dérivées de patients isolées dans notre laboratoire ; peut varier pour d’autres lignées cellulaires de gliome
EBM-2 croissance Medium SupplementMix	PromoCell	C-39216	EBM+ : contient tous les additifs du mélange de suppléments. EBM- :tous les additifs sauf VEGF-A et FBS
Milieu basal endothélial 2 (EBM-2)	PromoCell	C-22211	EBM+ : contient tous les additifs du mélange de suppléments. EBM- :tous les additifs sauf VEGF-A et FBS
Sérum fœtal bovin (FBS), qualifié, inactivé par la chaleur, approuvé par l’UE Origine Amérique du Sud	ThermoFisher Scientific	10500056
Sel de fluorescéine sodique	Sigma-Aldrich	Réf. F6377
Plaques à 96 puits Greiner CELLSTAR	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Puits en polystyrène noir à fond plat (avec fond micro-transparent)
Menzel-GlÄser 0,9 cm rond borosilicate Couvre-slips	Thermo Scientific	10313573
Comprimés PBS	Medicago	Tél. : 09-9400-100	Un comprimé par litre de dH2O, puis stériliser la solution par autoclave
Bromhydrate de poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
EGF humain recombinant	Peprotech	GMP100-15	Pour GBM+ medium
FGF humain recombinant (154 a.a.)	Peprotech	100 à 18 milliards	Pour GBM+ medium