Essai de perméabilité mimétique de la barrière hémato-encéphalique : un essai in vitro pour évaluer la perméabilité de l’imitation de la BHE aux molécules traceurs

Résumé

Source : Le Joncour, V. et al. Prédire l’administration de charges utiles in vivo à l’aide d’une barrière tumorale hémato-encéphalique dans une boîte. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo décrit un test de perméabilité permettant d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique in vitro à l’aide de molécules de fluorescéine sodique.

Protocole

1. Mesure de la perméabilité mimique BBTB
   

   1. La diffusion passive du colorant fluorescent sodium-fluorescéine (Na-Fl) de petit poids moléculaire dans le temps du sang vers le côté cérébral des inserts permet de calculer les valeurs de perméabilité selon la formule suivante :
      Ici, dFwell est la valeur de fluorescence mesurée dans le puits à un certain point temporel moins la valeur d’autofluorescence du milieu de culture cellulaire, dT est le temps en secondes, A est la surface de la barrière en centimètres carrés, et dFinsert est la valeur de fluorescence mesurée dans l’insert au même point de temps moins la valeur d’autofluorescence du milieu).
   2. Prélevez 100 μL du milieu du côté sanguin et du côté cérébral de l’imitation BBTB et transférez chacun d’eux sur une plaque noire à 96 puits à fond plat distincte pour les mesures de fluorescence ultérieures. Utilisez le support ordinaire comme blanc pour corriger l’autofluorescence.
   3. Préparez 2,5 mL par puits de Na-Fl (50 μM) dans EBM-. Préchauffez la solution de Na-Fl à 37 °C. Remplacez le milieu du côté sanguin des inserts par le milieu contenant du Na-Fl. Démarrez une minuterie dès que le fluide est remplacé.
   4. Prélever soigneusement 100 μL de milieu du côté sanguin et du côté cerveau des inserts à 5, 30, 60 et 120 min. Transférez chaque échantillon dans des puits séparés de la plaque noire à 96 puits.
   5. En conséquence, remplacez le support collecté des inserts pour maintenir l’équilibre du volume entre les deux côtés. Remettez les inserts dans l’incubateur entre chaque prélèvement d’échantillon afin de minimiser les variations de température.
   6. Quantifier la fluorescence des échantillons collectés, à l’aide d’un lecteur de plaques avec le filtre réglé sur 480/560 nm (excitation et émission, respectivement).
      note: La fluorescence du côté du cerveau est presque indétectable à 5 minutes. Des valeurs élevées par rapport à l'ébauche indiquent une fuite/un dommage à la membrane de l'insert ou à la barrière ; par conséquent, excluez-les des analyses ultérieures. Les valeurs de perméabilité Na-Fl attendues pour le BBTB doivent être de l’ordre de 10–5 à 10–6 cm/s (tableau 1).

Tableau 1 : Valeurs de la perméabilité sodium-fluorescéine (Na-Fl) (en centimètres par seconde) déterminées in vitro dans les systèmes de co-culture indiqués et in vivo chez les souris nues de l’INMN. Données d’une expérience représentative (n = 3 souris).

Murine BBTB mimique	bEND3	bEND3+HIFko As	bEND3+GB	bEND3+HIFko AS+GB	in vivo
Perméabilité (10 à 6 cm/s)	27,63	6,74	26,8	10,83	5,57
SD (10 à 6 cm/s)	3,45	3,01	7,99	2,65	2.19
Imitation humaine de BBTB	HuAR2T	HuAR2T+hIAs	HuAR2T+GB	HuAR2T+hIAs+GB
Perméabilité (10 à 6 cm/s)	104,92	47,4	89,08	48,24
SD (10 à 6 cm/s)	27,1	14.32	10.21	13.07

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériau et réactif
Pipette sérologique de 10 mL	ThermoFisher Scientific	170361
ABM Milieu basal, 500 mL	Lonza	CC-3187	Pour les astrocytes humains primaires. ABM+ : contient tous les additifs du mélange de suppléments. ABM- :tous les additifs sauf rhEGF et FBS
Aigle moyen basal	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Jambon F-12 Eagle's Modified Eagle's Medium/Nutrient	Gibco	Référence 21331-020	Spécifique à la culture des sphères dérivées du patient isolées dans notre laboratoire, peut varier pour d’autres lignées cellulaires de gliome
Greiner CELLSTAR 96 plaques puits S	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Puits en polystyrène noir à fond plat (avec fond micro-transparent)
Sel de fluorescéine sodique	Sigma-Aldrich	Réf. F6377
Lecteur de microplaques FLUOstar Omega	BMG Labtech
Cellules
bEND3	ATCC	CRL-2299	Culture dans : DMEM (1 g/L de glucose) complété par 10 % de FBS, 5 mL de L-glutamine et 5 mL de pénicilline/streptomycine
HIFko a immortalisé les astrocytes de souris	Isolé dans le laboratoire du Dr Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Culture dans : BME-1 supplémenté avec 5 % de FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM de pyruvate de sodium, 3 g de D-glucose et 5 mL de pénicilline/streptomycine
HuAR2T	Isolé dans le laboratoire de la Dre Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ ten.tea.2009.0184	Cultivé en : EBM-2 avec SupplementMix
Astrocytes primaires humains normaux	Lonza	CC-2565	Cultivé en : ABM avec SingleQuots