Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Homogénéisation
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à 4 °C.
- Ajouter 1,5 mL de tricaïne (15 mM) dans des boîtes de Pétri de 90 mm contenant 50 larves dans 50 mL de milieu embryonnaire E3 traité avec 200 μM de PTU pour les anesthésier finalement.
- Aspirez 10 larves anesthésiées des boîtes de Pétri à l’aide d’une pipette en plastique en vrac de 3 mL
.
- Transférez les larves anesthésiées 10 par 10 dans une boîte de Pétri de 55 mm remplie d’un milieu embryonnaire E3 glacé + tricaïne.
- À l’aide d’un stéréomicroscope, alignez 10 larves au centre de la boîte de Pétri. Ensuite, transectez les têtes larvaires au-dessus du sac vitellin à l’aide de micro-ciseaux chirurgicaux (excluez la vessie natatoire pour éviter les têtes flottantes).
- Aspirez les têtes des boîtes de Pétri à l’aide d’une pipette en plastique en vrac Pasteur de 3 ml. Attendez que toutes les têtes se rassemblent à l’intérieur de la pointe de la pipette, puis transférez-les dans un homogénéisateur en verre contenant 1 mL de média A glacé (transfert dans un volume minimal pour réduire la dilution du média A par E3 + tricaïne). Gardez l’homogénéisateur en verre sur de la glace. Utiliser un homogénéisateur par condition expérimentale.
- Remplacez chaque petite boîte de Pétri contenant de la glace E3 + Tricaïne par une nouvelle toutes les 30 minutes pour vous assurer que la transsection est effectuée dans un milieu froid E3 + Tricaïne.
- Remplacez le support A glacé dans l’homogénéisateur en verre lorsque la couleur commence à s’estomper.
REMARQUE : Média Une dilution peut altérer le tissu de la tête en raison des changements de température.
- Une fois que toutes les têtes ont été recueillies (600 têtes/état), retirez le volume maximal de média A de l’homogénéisateur en verre et remplacez-le par 1 mL de substrat A frais et glacé.
- Perturbez le tissu cérébral avec un homogénéisateur de verre étanche sur de la glace. Effectuez 40 tours d’écrasement pour 3 à 5 larves de dpf et 50 pour les larves de 7 et 8 dpf.
- Ajouter 2 mL de média A à la suspension cellulaire (1 mL de média A/200 têtes), ce qui permettra de diluer les cellules et de réduire leur agglomération avec de la myéline pour faciliter leur séparation lors de la centrifugation dans un milieu à gradient de densité.
- Pour éliminer l’agglomération cellulaire, faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 μm placée au-dessus d’un tube faucon froid de 50 ml maintenu sur de la glace. Répétez cette opération 3 fois.
- Transvasez 1 mL de suspension cellulaire dans des tubes froids de 1,5 mL et faites-les tourner à 300 g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant à l'aide d'une seringue de 10 ml + aiguille 23G x 1''.
- Remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu glacé à gradient de densité de 22 % doucement recouvert de 0,5 mL de DPBS 1x glacé (ne les mélangez pas, une interphase entre les deux solutions sera observée).
- Tubes de centrifugation à 950 g sans frein et accélération lente pendant 30 min à 4 °C.
REMARQUE : Cette étape sépare la myéline des autres cellules en la séquestrant à l’interphase du milieu DPBS 1x et du gradient de densité de 22 %, tandis que les cellules se granuleront au fond du tube. L’élimination de la myéline est plus efficace lorsque la concentration cellulaire n’est pas trop élevée.
- À l'aide d'une seringue de 10 ml + aiguille 23G x 1'', jeter le maximum de DPBS, de milieu à gradient de densité et de myéline piégée à leur interphase.
- Laver les cellules avec 0,5 mL de milieu A + 2 % de sérum de chèvre normal (NGS), puis faire tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 °C.
- Jetez le maximum de surnageant, puis regroupez toutes les pastilles de cellules provenant des mêmes conditions expérimentales dans 1 mL de milieu A + 2 % NGS.
- Si les cellules d’intérêt expriment des macrophages/microglies fluorescents semblables à des protéines à partir de mpeg1 :eGFP ou des neurones de poissons transgéniques NBT :DsRed, faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine cellulaire de 35 μm et transférez-les dans des tubes FACS froids de 5 ml sur de la glace, à l’abri de la lumière.
REMARQUE : Alternativement, l’immunocoloration de la microglie peut être effectuée.