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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Immunocoloration microgliale
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à 4 °C.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire obtenue à partir de cellules de culture cérébrale avec 0,3 mL de milieu A + 2 % de sérum de chèvre normal ou NGS. Divisez-les en 3 tubes de 1,5 mL : un pour les cellules non colorées afin de mesurer l’autofluorescence des cellules d’intérêt, un deuxième pour l’anticorps secondaire (1/200) pour mesurer la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire à la microglie, et un troisième comme test (anticorps monoclonal de souris 4C4 (spécifique de la microglie) (1/20) + anticorps secondaire (1/200)).
- Ajouter une faible teneur en endotoxines, sans azoture (LEAF) à 1 % aux cellules (tous les tubes) pour bloquer les interactions CD16/CD32 avec le domaine Fc des immunoglobulines. Incuber les cellules pendant 10 min avec une légère agitation toutes les 5 min.
- Ajouter l’anticorps 4C4 (1/20) aux cellules (tube 3) et incuber pendant 30 min en agitant doucement toutes les 10 min.
- Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 °C, puis jetez le surnageant.
- Laver une fois avec 0,5 mL de média A + 2 % NGS, puis essorer les tubes à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 0,5 ml de milieu A + 2 % NGS et incuber les cellules avec LEAF à 1 % pendant 10 min avec une légère agitation toutes les 5 min.
- Ajouter l’anticorps secondaire (1/200) aux cellules (tubes 2 et 3). Incuber les cellules pendant 30 min avec une légère agitation toutes les 10 min et une protection légère.
- Essorer les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 °C, puis jeter le surnageant.
- Laver deux fois avec 0,5 mL de média A + 2 % NGS, puis remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de média A + 2 % NGS.
- Faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine de cellule de 35 μm et transférez-la dans des tubes froids de tri cellulaire de 5 ml activés par fluorescence ou des tubes FACS sur de la glace, à l’abri de la lumière.
2. Tri des cellules (FACS)
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes à 4 °C.
- Triez les neurones, les macrophages/microglies et les microglies à l’aide d’un FACS.
REMARQUE : Cette étape est généralement effectuée par un membre du personnel de l’installation FACS et les paramètres dépendent du type d’équipement utilisé.
- Ajouter du DAPI à une concentration de 1 μg/mL dans chaque tube FACS pour marquer les cellules mortes.
- Configurez FACS et triez les neurones, les macrophages/microglies ou les microglies de toutes les cellules du cerveau. Séparez les cellules des débris en fonction de leur taille et de leur granularité, puis gatez les cellules individuelles par diffusion vers l’avant et par diffusion latérale. Exclure les cellules mortes par marquage DAPI des cellules vivantes. Identifiez les neurones, les macrophages/microglies ou les microglies par leur coloration positive respective.
- Prélever les cellules dans des tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de média glacé A + 2 % NGS sur glace. Utilisez des tubes différents pour chaque type de cellule.
- Faites tourner les tubes à 300 x g pendant 10 min à 4 °C, puis jetez le surnageant.
- Laver une fois avec 0,5 mL de média A, puis jeter le maximum de surnageant.