Décellularisation du complexe cardio-pulmonaire : une technique de décellularisation du cœur et des poumons à partir d’un modèle murin

Abstract

Source : Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Décellularisation du complexe cardio-pulmonaire murin. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo présente une méthode de production d’échafaudages à matrice extracellulaire décellularisée ou ECM en appliquant une perfusion antérograde de détergents à travers le système vasculaire. Les échafaudages structurels de la MEC peuvent ensuite être utilisés pour analyser le remodelage de la MEC associé aux maladies cardiopulmonaires.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Microchirurgie post-mortem

1. Euthanasier la souris à l’aide d’une chambre à CO₂.
   1. Placez la souris dans une chambre de 4 L et commencez à remplir avec 100 % de CO₂, en commençant à 0,2 L/min pendant 2 min, augmentant jusqu’à atteindre un débit de 0,8 L/min après 3 min. La souris doit tomber inconsciente pendant les 2 premières minutes, puis la respiration doit cesser (généralement vers 5 min, mais le débit peut être maintenu si nécessaire). Confirmez le décès avant de passer à l’étape suivante.
2. Rasez le thorax, l’abdomen et le dos de la souris avec la tondeuse à cheveux et désinfectez avec de l’éthanol à 70 %. Le rasage réduit considérablement le nombre d’artefacts en raison de la présence de poils sur les échantillons pour l’imagerie ou l’analyse biochimique.
3. Épinglez la souris à un plateau en polystyrène, en étendant ses membres antérieurs et postérieurs, ainsi que sa tête et sa queue. Placez-le sous le microscope de microchirurgie.
4. À l’aide de ciseaux à motif droit Mayo, établissez un accès chirurgical avec une incision cutanée allant de la région sous-mandibulaire au bas-ventre et disséquez sous-cutané pour exposer la paroi thoracique et le péritoine.
5. À l’aide de ciseaux microchirurgicaux, coupez les muscles pectoraux grand et petit le long du sixième espace intercostal des deux côtés de la paroi thoracique.
6. À l’aide de ciseaux droits, coupez le sternum le long des incisions précédentes, puis complétez une sternotomie en coupant le sternum le long de son axe long, puis élevez et épinglez les deux côtés de la paroi thoracique pour exposer le complexe cardiopulmonaire.
7. À l’aide d’une micro-pince à bout rond (ou micro-pince Dumont), excisez le thymus et le tissu adipeux environnant en les retirant délicatement de leurs attaches. Cela permettra de révéler les principaux navires.
8. À l’aide de la cautérisation, cautérisez la veine cave descendante et, à l’aide de ciseaux à motif droit, coupez l’œsophage.
9. À l’aide de micro-pinces tranchantes, séparez les veines brachiocéphales et les artères brachiocéphalique, carotidienne commune gauche et sous-clavière gauche du tissu sous-jacent pour faciliter la ligature et la cautérisation.
10. À l’aide d’un porte-micro-aiguille, d’une micro-pince tranchante et d’une suture 9-0, placez les points de suture au-dessus de l’émergence de l’artère brachiocéphale, de la carotide commune gauche et de l’artère sous-clavière gauche.
11. Cautériser les veines brachiocéphales.
12. Séparez les glandes salivaires sous-mandibulaires le long de la ligne médiane pour exposer les muscles du cou et la trachée. Séparez les muscles pour exposer le ligament cricothyroïdien. À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez une entrée en sectionnant le ligament.
13. Introduisez un cathéter de 27 G dans la trachée et poussez délicatement jusqu’à ce que la trachée se ramifie dans les bronches (c’est-à-dire jusqu’à ce qu’une résistance au cathéter soit rencontrée, puis reculez de 3 mm). Attention à ne pas perturber les bronches. À l’aide d’une suture 6-0, placez 3 points de suture autour de la trachée pour fixer le cathéter.
14. Sectionnez la souris à la hauteur de la 12e vertèbre thoracique. L’aorte descendante passe en avant de la colonne vertébrale et doit être sectionnée ici avec la colonne vertébrale. Séparez la moitié inférieure.
15. Cathétériser rétrogradement l’aorte et pousser le cathéter jusqu’à ce qu’il atteigne l’arc aortique. À l’aide d’une suture 9-0, placez 4 points de suture autour de l’aorte, en commençant à 5 mm sous l’extrémité du cathéter.

2. Décellularisation

1. Connectez la souris à un système de pompe à l’aide d’un tube en silicone et de connecteurs Luer. Perfuser avec de l’eau déminéralisée à 200 μL/min pendant 15 min. Maintenez ce débit pendant la décellularisation.
2. Changez l’agent de perfusion en désoxycholate de sodium (COD) à 0,5 % dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant la nuit.
3. Changez l’agent de perfusion en dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1 % dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant 8 heures.
4. Perfuser avec de l’eau déminéralisée pendant la nuit pour éliminer les FDS et DOC pendant 24 h.
5. Réséquez le cœur et les poumons décellularisés en sectionnant ses attaches au thorax à l’aide de ciseaux incurvés et conservez-les dans un cryotube stérile avec de l’eau désionisée contenant 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 0,3 μM d’azoture de sodium à 4 °C. Les échafaudages ECM peuvent être stockés pendant au moins 12 semaines. Si l’échafaudage doit être utilisé pour l’analyse biochimique (p. ex., spectrométrie de masse), congelez-le instantanément dans de l’azote liquide.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microchirurgie
Suture 6-0, aiguille à section triangulaire (Vicryl)	Éthicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Pince Adson	Outils scientifiques fins	Référence 11006-12
Pince Adson avec dents	Outils scientifiques fins	Référence 11027-12
Porte-micro-aiguilles Castroviejo	Outils scientifiques fins	Référence 12061-01
Chambre de ventilation au CO2 pour l’euthanasie des souris
Eau déminéralisée (Milli-Q IQ 7000, système d’eau de laboratoire ultrapure)	Merck	ZIQ7000T0
Barquette jetable en polystyrène (~30 × 50 cm)
Microscope de dissection (Greenough, avec col de cygne à deux bras)	Leica	S6 D
Microspatule à double embout	Outils scientifiques fins	Référence 10091-12
Micropinces Dumont (deux)	Outils scientifiques fins	Référence 11252-20
Micropinces Dumont avec pointes à 45°	Outils scientifiques fins	Référence 11251-35
Tondeuse à cheveux	Oster	Référence 76998-320-051
Porte-aiguille Halsey (avec mâchoires en carbure de tungstène)	Outils scientifiques fins	Référence 12500-12
Cathéter intraveineux de calibre 24 (Insyte)	Bd	381512
Cathéter intraveineux de calibre 26 (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Ciseaux Mayo (coupe dure, droit)	Outils scientifiques fins	Référence 14110-15
Micropinces à pointes annelées	Aesculap	FM571R
Ciseaux à micro-ressort (Vannas, courbés)	Outils scientifiques fins	Référence 15001-08
Aiguilles (calibre 27 ; Microlance)	Bd	Référence 21018
Serviette en papier (stérile) ou serviette chirurgicale
Ciseaux dentelés (CeramaCut, droits)	Outils scientifiques fins	Référence 14958-09
Spatule (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Seringues (1 ml ; Plastipak)	Bd	3021001
Seringues (10 ml ; Plastipak)	Bd	3021110
Ciseaux à tendon (Walton)	Outils scientifiques fins	Référence 14077-09
DÉCELLULARISATION
Éthanol à 70 % (alcool absolu à 99,9 %) ; l’alcool absolu doit être ajusté à 70 % (vol/vol) à l’aide d’eau désionisée	prune	1680766
Eau déminéralisée (Milli-Q IQ 7000, système d’eau de laboratoire ultrapure)	Merck	ZIQ7000T0
Raccords mâles Luer-à-tube (1/8 pouce)	Instruments de précision mondiaux	Référence 13158-100
Raccords mâles Luer-à-tube (1/8 pouce)	Instruments de précision mondiaux	Référence 13158-100
PBS (pH 7,4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140122
Pompe péristaltique (avec 12 canaux)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Tube en silicone (avec 2 mm de diamètre intérieur et 4 mm de diamètre extérieur)	Ole Dich	Référence 31399
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich	Référence 08591-1ML-F
Désoxycholate de sodium (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G