Isolement de l’épithélium des papilles circonvallates (CVP) à partir d’un modèle murin : une procédure enzymatique pour séparer l’épithélium CVP de la langue de souris

Résumé

Source : Shechtman, L. A. et al. Génération et culture d’organoïdes linguaux dérivés de cellules souches de goût de souris adultes. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous décrivons l’isolement de l’épithélium des papilles circonvallées (CVP) à partir d’une langue murine.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Isolement de l’épithélium CVP

1. Euthanasier les souris par asphyxie au CO₂ conformément à la réglementation de l’IACUC, suivie d’une méthode secondaire approuvée telle que la thoracotomie bilatérale, la luxation cervicale, la décapitation ou l’exsanguination.
2. Utilisez de grands ciseaux de dissection stériles pour couper les joues et casser la mâchoire. Soulevez la langue et coupez le frein lingual pour séparer la langue du plancher de la cavité buccale. Découpez la langue et recueillez-la dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (dPBS) stérile et glacée avec Ca²⁺ et Mg²⁺.
3. Retirez et jetez la langue antérieure en coupant juste en avant de l’éminence intermolaire avec une lame de rasoir (Figure 1A, ligne pointillée). Utilisez une lingette délicate pour enlever les poils et l’excès de liquide de la langue postérieure.
4. Remplissez une seringue de 1 mL avec 200 à 300 μL de solution d’enzyme d’injection (concentration finale : 2 mg/mL de collagénase de type I et 5 mg/mL de dispase II en Ca²⁺/Mg²⁺-contenant du dPBS, dilué à partir de solutions mères de 10 mg/mL) et insérez une aiguille de 30 G x 1/2 juste au-dessus de l’éminence intermolaire (Figure 1B, flèche noire) jusqu’à ce qu’il soit juste en avant du PVC (Figure 1B, boîte noire). Injectez la solution enzymatique sous et sur les bords latéraux du CVP entre l’épithélium et les tissus sous-jacents (lamina propria, muscle). Retirez la seringue lentement et continuellement de la langue au fur et à mesure de l’injection.
5. Incuber la langue en ca="font-size : 10.8333px ;">2+/Mg²⁺-free dPBS à température ambiante pendant précisément 33 min.
6. Faites de petites incisions dans l’épithélium bilatéralement et juste en avant du CVP à l’aide de ciseaux de dissection extra fins, et pelez doucement l’épithélium en le soulevant avec une pince fine. Une fois que l’épithélium de la tranchée est exempt de tissu conjonctif sous-jacent, placez-le dans un tube de microcentrifugation vide de 2 ml pré-enduit de FBS. Effectuez la coupe épithéliale avant ou après le détachement de l’épithélium CVP (Figure 1C, D).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 mL de TB	Seringue BD	309659
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec Ca²⁺ et Mg²⁺	Gibco	Référence 10010-023
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec Ca²⁺ et Mg²⁺	Sigma Sciences de la Vie	D8662-500ML
Pince Dumont #5	Outils scientifiques fins	Référence 11252-30
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	Référence 26140-079
Seringue de 1 mL de TB	Seringue BD	309659
Tubes de microcentrifugation de 2,0 ml	Scientifique américain	1420-2700
Ciseaux chirurgicaux - Sharp	Outils scientifiques fins	Référence 14002-14
Ciseaux Bonn extra fins	Outils scientifiques fins	Référence 14084-08
Minuterie/chronomètre à gros chiffres	Fisher Scientific	S407992
Stéréomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Ciseaux à ressort Cohan-Vannas	Outils scientifiques fins	Référence 15000-02
Collagénase de Clostridium histolyticum, type I	Sigma Sciences de la Vie	Réf. C0130-1G
Dispase II (protéase neutre, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001