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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des microbulles
- Préparation de microbulles pour injection
note: L’assistant effectue cette étape lorsque l’injection de microbulles (MB) dans les embryons est commencée. Chaque embryon est injecté une fois, le type de microbulle choisi pour chaque injection étant sélectionné au hasard par l’assistant de sorte que tous les types de microbulles soient uniformément répartis tout au long de la procédure, mais dans un ordre aléatoire. Assurez-vous que le chirurgien ne connaît pas le type de bulle injectée.
- Déterminer le volume de solution mère à bulles nécessaire pour produire une concentration finale de 1 x 108 MB/mL dans un volume de 400 μL (calculer le volume à l’aide des concentrations de stock). Aliquote le volume correspondant de solution saline dans un tube de microcentrifugation vide.
- Agitez doucement le flacon de microbulles sélectionné et aspirez un volume excédentaire (~50 μL supérieur à celui calculé ci-dessus) de la solution dans une seringue de 1 mL à l’aide de l’aiguille de 21 G. Injectez les microbulles dans un tube de microcentrifugation vide.
- Pipeter le volume nécessaire de solution mère de microbulles et l’ajouter à l’aliquote de solution saline. Mélangez en remuant doucement avec l’extrémité de la pipette.
- Aspirez la solution de microbulles diluée dans une seringue propre à l’aide de l’aiguille de 21 G. En retirant l’aiguille, éliminez toutes les bulles d’air de la seringue et fixez le luer et la tubulure. Poussez lentement la solution jusqu’à l’extrémité du tube en veillant à ne pas générer de bulles d’air.
- Insérez la seringue dans un ensemble de pompe à perfusion pour distribuer les microbulles à un débit de 20 μL/min pour un volume total de 20 μL. Fixez une aiguille en verre tirée à l’extrémité de la tubulure. Déplacez la pompe près de l’étape d’injection.
2. Injection de microbulles dans les embryons
- Sélectionnez et retirez au hasard (avec une cuillère perforée) un embryon du plat de milieu réfrigéré. Placer dans une boîte de dissection située sur la platine d’échographie sous le stéréoscope et retirer le sac vitellin et les membranes amniotiques à l’aide de la pince fine, en coupant/déchirant du côté qui semble le moins vascularisé (le côté anti-temporisé). Ceci est plus facile à réaliser en perçant une zone adjacente à la région de la tête.
- Coupez suffisamment pour retirer l’embryon de l’intérieur, mais pas plus. Stabilisez les boîtes de dissection à l’aide de petits morceaux de pâte à modeler.
- Manœuvrez doucement le sac autour de l’embryon. Positionnez l’embryon sur le côté, avec le placenta et les vaisseaux ombilicaux devant. À l’aide des épingles à insectes, épinglez le sac vitellin (4 épingles recommandées) et les bords du placenta si nécessaire pour les fixer en place. Évitez les gros navires.
- Lavez l’embryon avec du PBS préchauffé à 45 °C jusqu’à ce que l’embryon revienne. Identifier la veine ombilicale et son réseau vasculaire associé. Positionnez la parabole de manière à ce que l’injection puisse être effectuée confortablement.
note: Une fois réchauffé, le sang dans l’embryon commencera à circuler, pompant visiblement dans l’artère ombilicale. Lorsque le flux commence pour la première fois, les veines seront d’un rouge vif, le sang dans les deux vaisseaux apparaissant rapidement identique. Les branches provenant de la veine ombilicale recouvrent généralement celles de l’artère ombilicale à la surface du placenta.
- Une fois que l’embryon a été ranimé, couvrez-le (mais pas le placenta) de gel US préchauffé, en veillant à éliminer délicatement les bulles d’air (à l’aide de la pince fine) autour de l’embryon. Complétez le plat avec du PBS préchauffé.
note: Gardez un œil sur le niveau de solution dans les seringues PBS et gel et ajoutez des seringues de secours dans le bécher chauffant si nécessaire.
- Montez l’aiguille en verre sur une grosse boule de pâte à modeler sur le bord du plat de dissection et insérez l’extrémité de l’aiguille dans le PBS. En choisissant une veine sur la surface choriale du disque placentaire, aussi éloignée que possible de la branche principale, coupez la pointe à la bonne taille à l’aide de ciseaux. L’injection est plus facile si la pointe est coupée légèrement en biais. Retirez tous les bords déchiquetés du verre à l’aide du bord des ciseaux à ressort.
- À l’aide de la pompe à seringue, injectez lentement la solution de microbulles à 20 μL/min dans l’aiguille en verre jusqu’à ce que tout l’air soit expulsé de la pointe de l’aiguille et que l’on puisse voir les microbulles s’écouler librement dans le PBS. Arrêtez la pompe et réinitialisez-la pour un volume d’injection de 20 μL. Ne laissez pas l’air pénétrer dans le système vasculaire de l’embryon pendant l’injection.
- Insérez doucement la pointe de l’aiguille de verre dans l’une des veines du placenta et assurez-vous qu’elle est immobile. Écartez la tête du stéréoscope et placez le transducteur au-dessus de l’embryon. Lancez l’imagerie.