Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’écouvillonnage oculaire, configuration du terrain de travail, écouvillonnage de l’œil de souris et enrichissement de l’échantillon
- Préparer des écouvillons oculaires stériles
note: Les écouvillons oculaires stériles sont des cure-dents en bois finement enduits d’une fine couche de ouate de coton et fabriqués en interne.
- Autoclave la quantité appropriée de ouate de coton et de cure-dents pour le nombre de souris à écouvillonner.
- Pincez un morceau de ouate d’un demi-centimètre de long avec le pouce et l’index. Retirez le molleton en tirant sur les bords avec les pouces et les index pour former une seule couche poreuse plate, en s’arrêtant juste avant que le molleton ne se désagrège (de petits morceaux de coton dispersés dans le molleton étiré sont acceptables).
- Faites tourner le molleton autour de l’une des extrémités pointues du cure-dent en tenant légèrement la pièce étirée sur la pointe du cure-dent pendant qu’elle est tordue, voir Figure 1. L’écouvillon oculaire « terminé » aura une très fine couche de coton étirée sur la pointe, s’étendant d’environ un demi-centimètre à un centimètre de la pointe.
- Insérez les écouvillons « terminés » dans le petit bécher, l’écouvillon vers le bas et couvrez le filet. Autoclave.
- Configurer l’espace de travail
- Préparez un anesthésique contenant 2 mL de kétamine (100 mg/mL), 400 μL de xylazine (100 mg/mL) et 27,6 mL de solution saline stérile (0,9 % de NaCl dans dH₂O) dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Filtrer la stérilisation et l’aliquote anesthésie pour une utilisation immédiate (peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois ; toujours laisser équilibrer à la température ambiante avant utilisation).
- Nettoyez et nettoyez la zone de travail avec un désinfectant pour minimiser la contamination.
- Aliquote 0,5 mL de milieu de perfusion Cerveau-Cœur stérile (BHI) dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL marqués (1 tube par souris et témoin) ; disposer dans le support de la microcentrifugeuse. Placez la grille sur de la glace.
- Configurez le flux de travail comme suit (de gauche à droite) : station d’anesthésie pour souris (cage contenant des souris expérimentales, cage stérile vide, anesthésie à température ambiante, aiguille de 25 g et seringue de 1 ml), station d’écouvillonnage oculaire (BHI aliquote sur glace, écouvillons oculaires stérilisés, essuie-tout propres, spray d’isopropanol à 70 %) et station de placage (plaques de gélose au sang à température ambiante, pipette de 10 μL, Embouts stériles jetables de 10 μL, conteneur à déchets biologiques).
- Écouvillonnage oculaire
- Administrer 10 μL d’anesthésie par 1 g de poids de souris, respectivement par voie intrapéritonéale à chaque souris adulte et placer dans une cage autoclave. Testez l’anesthésie en pressant le coussinet de l’arrière-pied ; Aucun mouvement n’indique une anesthésie appropriée.
- Attribuez une main uniquement pour manipuler les souris anesthésiées et l’autre main pour manipuler uniquement l’écouvillon oculaire et la culture. Pour l’écouvillonnage, retirez la souris complètement anesthésiée de la cage ; Placer sur une surface de travail propre positionnée sur le côté avec l’œil gauche exposé. Vaporisez les mains gantées d’isopropanol, séchez avec une serviette en papier propre.
- Débouchez le tube de micro-centrifugeuse BHI spécifiquement étiqueté avec une main dédiée à la manipulation des supports. Remettez le tube dans le support de la micro-centrifugeuse sur de la glace. Trempez l’extrémité recouverte de coton de l’écouvillon oculaire dans du BHI, retirez l’écouvillon oculaire du tube en faisant tourner l’embout 2 fois contre le tube intérieur pour éliminer l’excès de liquide.
- Avec la main de manipulation de la souris, tenez doucement la souris par la peau du cou. De l’autre main, placez l’extrémité de l’écouvillon oculaire contre la région conjonctivale médiale de l’œil gauche, voir Figure 2A. Appuyez légèrement sur le globe oculaire et déplacez l’écouvillon dans un mouvement de lavage de vitres (Figure 2B) d’avant en arrière, entre la paupière inférieure et l’œil, 10 fois. Maintenez une pression constante.
- Sans toucher la fourrure, retirez délicatement l’extrémité de l’écouvillon, perpendiculairement à l’endroit où il a été inséré, et placez l’écouvillon côté coton vers le bas directement dans un tube de micro-centrifugeuse étiqueté contenant du milieu BHI. Appliquez un collyre lubrifiant sur l’œil écouvillonné.
- Remettez la souris dans la cage.
- Laissez l’écouvillon reposer pendant 10 à 15 minutes sur de la glace et retirez l’écouvillon oculaire avec la main gantée stérilisée en mélangeant l’embout dans le milieu pendant 10 rotations. Retirez l’écouvillon en tournant l’embout contre la paroi intérieure du tube de micro-centrifugeuse pendant 5 tours. Jetez l’écouvillon dans un contenant pour matières biologiques.
- Répéter les étapes 1.3.2 à 1.3.7 pour chaque souris et pour les échantillons de contrôle (écouvillon de peau ou de fourrure). Stérilisez les gants de manière appropriée entre chaque écouvillon.
- enrichissement
- Enrichir l’échantillon en incubant le tube de manière statique pendant 1 h à 37 °C
- Pendant l’incubation, étiquetez une plaque de gélose trypticase à température ambiante avec une plaque de gélose au sang de mouton à 5 % (plaque TSA) par souris et divisez-la en deux.
- Après l’incubation de la culture par écouvillonnage oculaire, retirer les échantillons enrichis de l’incubateur et les placer sur de la glace.
- Échantillonner brièvement des vortex à mélanger et à plaquer selon le schéma de la figure 3A. Aliquote 10 μL de l’échantillon sur la plaque TSA et inclinez la plaque pour former une bande, répétez 2 fois.
- De l’autre côté de la ligne de démarcation de la plaque, détacher 10 μL d’échantillon sur de la gélose, répéter l’opération 9 fois.
- Incuber les plaques à 37 °C pendant 18 h, 2 jours et 4 jours (dans une chambre propre qui empêche les plaques de gélose de sécher). Compter les colonies en bandelettes, noter la morphologie et calculer les unités formant colonies (UFC) par écouvillon pour des isolats morphologiquement similaires. Regardez les points pour les organismes uniques qui ne sont pas capturés dans des bandes.