Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des appareils de solution et de perfusion
- Assemblez un appareil Langendorff à débit constant (disponible dans le commerce ou fabriqué par vous-même). La figure 1 présente un schéma simple.
- Préparez les solutions en fonction des réactifs indiqués dans les tableaux 1 et 2.
- Allumez le bain-marie en circulation et ajustez une température d'entrée appropriée (42,7 °C dans notre laboratoire) pour vous assurer que le débit sortant du système de circulation de perfusat de la canule atteint 37 °C.
- Nettoyez le système de perfusion en faisant circuler de l’eau déminéralisée. Si une condition stérile est requise, faites passer de l’éthanol à 75 % dans le système de perfusion pendant 15 min, suivi d’eau désionisée (au moins 10 cycles pour éviter les effets toxiques de l’alcool sur le cœur).
- Mesurez le temps et le volume d'un cycle du système de circulation des perfusats pour déterminer combien de millilitres de solution oxygénée de Tyrode doivent être chargés à l'étape de perfusion suivante.
- Stérilisez tous les outils chirurgicaux selon la méthode souhaitée.
- Régler le débit du système de perfusion de perfusat à 4 mL/min.
- Préparez deux boîtes de Pétri propres de 35 mm, l'une contenant la solution de Tyrode (boîte de Pétri 1), l'autre contenant la solution 1 (boîte de Pétri 2).
- Préparez une seringue de 1 mL remplie de la solution 1 et une aiguille de canule en acier émoussé de 20 g avec une encoche à partir de laquelle la distance est de 1 mm par rapport à l’extrémité. Préparez un nœud lâche avec une suture 3-0 sur la tige de la canule. Réglez le champ de vision du stéréomicroscope et assurez-vous que l’extrémité de la canule se trouve sous la surface liquide de la boîte de Pétri 2.
2. Préparation des animaux
- Administrer de l’héparine (concentration, 1 000 UI/mL ; 0,2 mL/souris) par voie intrapéritonéale aux souris pour éviter la formation de caillots sanguins. Après 10 min, anesthésez les souris avec du pentobarbital sodique (50 mg/kg, injection I.P.) et assurez-vous que les souris cessent de répondre aux pincements de la queue ou des orteils. Effectuer une luxation cervicale 20 min après l’administration d’héparine.
- Transférez les souris sur la plate-forme chirurgicale, fixez-les en position couchée, stérilisez la poitrine avec de l’éthanol à 75 % et séchez-la avec de la gaze ou une serviette.
3. Excision du cœur et canulation de l’aorte
- Soulevez la peau du xiphoïde à l’aide d’une pince à tissus et faites une incision latérale mineure à travers la peau avec des ciseaux à tissus. Effectuez une dissection contondante entre la peau et le fascia et étendez l’incision de la peau en forme de V vers les aisselles des deux côtés.
- Continuez le même tracé d’incision à travers la cage thoracique, puis déviez la cage thoracique vers le haut en serrant le sternum avec une pince à tissu pour exposer complètement le cœur et les poumons.
- Décollez le péricarde à l’aide d’une pince incurvée. Déchirez le thymus des deux côtés à l’aide de deux pinces incurvées si elle recouvre les gros vaisseaux. Tirez doucement la base du cœur vers la queue à l’aide d’une pince incurvée jusqu’à ce qu’un vaisseau sanguin en forme de « Y » (l’aorte et ses artères ramifiées) soit visible.
- Pour réserver différentes longueurs de l’aorte à la canulation et à la comparaison, transectez l’aorte au niveau de l’artère carotide commune gauche (ligne verte sur la figure 2) et coupez l’artère brachiocéphale en même temps chez certaines souris. Transect au niveau de l’aorte ascendante chez d’autres souris (ligne noire sur la figure 2).
note: Pour ceux qui débutent dans cette procédure, cette étape peut également être effectuée sous un microscope stéréoscopique.
- Excisez le cœur et plongez-le immédiatement dans la boîte de Pétri 1 pour laver et pomper le sang résiduel.
- Transférez le cœur dans la boîte de Pétri 2 et coupez tout surplus de tissu à l’aide de ciseaux à iris fins si nécessaire. Pour ceux qui sont novices dans cette procédure, faites cette étape sous le stéréomicroscope pour éviter de couper par erreur l’aorte ou d’autres structures cardiaques.
- Poussez la seringue pour expulser les bulles d’air avant la canulation de l’aorte. Effectuez une canulation rétrograde de l’aorte à l’aide de deux pinces à attacher droites (mâchoires lisses) sous le stéréomicroscope. Assurez-vous que tout le processus de canulation se trouve sous la surface du liquide.
- Évitez de pénétrer dans les valves aortiques et ajustez les profondeurs à l’aorte ascendante (la souris dont l’aorte a été transectée à l’artère carotide commune gauche) et à la racine aortique (la souris dont l’aorte a été transectée à l’aorte ascendante), respectivement.
note: La profondeur de la canulation de l’aorte (appelée simplement profondeur) est définie ici comme la position où se trouve l’extrémité de la canule dans l’aorte ou où l’aorte est ligaturée.
- Lister l’aorte avec la suture pré-noeudée 3-0 à l’encoche de la canule. Appuyez doucement sur le contenu de la seringue pour rincer le sang résiduel.
note: Le sang quittera les artères coronaires et s’écoulera des veines dorsales si la profondeur est correctement positionnée. Le cœur et les appendices auriculaires vont se dilater et devenir pâles.
- Retirez et connectez la canule à l’appareil de Langendorff. Encore une fois, veillez à ce que des bulles d’air ne pénètrent pas dans le cœur.
note: Sachez que le temps entre la thoracotomie et la perfusion initiale ne doit pas dépasser 5 min.
- Pour la perfusion cardiaque, amorcez et perfuser la solution oxygénée de Tyrode pendant environ 10 s (le volume de liquide fonctionnant pendant 10 s dans le système utilisé dans ce protocole est d'environ 0,7 mL) s'il y a du sang résiduel dans les oreillettes, puis passez à la solution 1. Cependant, il suffit de perfuser avec la solution 1 s’il n’y a pas de sang résiduel dans les oreillettes. Perfuser le cœur pendant environ 2 min.
Table 1. Solutions pour l’isolement de la CM de souris adultes.
| solution | Contenu (concentration finale en mmol/L, sauf indication contraire) | renommé |
| Solution de perfusion (solution 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurine, 5 Glucose, 10 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Qui peut être conservé pendant 3 jours à 4 °C. Du glucose, de la taurine et du BDM sont ajoutés le jour de l’expérience. Préparez 200 ml de solution de perfusion pour chaque cœur. |
| La solution de Tyrode (solution 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glucose | Qui peut être stocké pendant 3 jours à 4 °C. Le CaCl2 et le glucose sont ajoutés le jour de l’expérience, ajustez le pH à 7,3-7,4 avec du NaOH saturé à température ambiante (28-30 °C) avec un pH-mètre. |
Tableau 2. Solutions pour l’isolement et le stockage des CM de souris adultes.
| solution | contenu | renommé |
| Solution de digestion (solution 3) | 25 mL de solution 1, 6 μL, 100 mM/L de CaCl2, 25 mg de collagénase II, 50 μL (2,5 % 10×) trypsine | Pour chaque cœur |
| Solution d’arrêt 1 (solution 4) | 9 mL de solution 1, 1 mL de FBS (sérum de veau fœtal), 4μL 100 mM/L de CaCl2 | Pour chaque cœur |
| Solution d’arrêt 2 (solution 5) | 9,5 mL de solution 1, 0,5 mL de FBS (sérum de veau fœtal), 4μL 100 mM/L de CaCl2 | Pour chaque cœur |
| Solution de remise en suspension cellulaire (solution 6) | 13 mL de solution 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) à une dose pouvant former une fine couche recouvrant la surface du liquide | Pour chaque cœur |
