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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE
1. Préparation de la solution de colorant bleu de méthylène
- Mesurer 0,1 g de poudre de bleu de méthylène.
- Dissoudre complètement le bleu de méthylène dans 10 mL de solution saline normale ou 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par vortex.
- Filtrez la solution de bleu de méthylène à 10 mg/mL à l’aide d’un filtre à seringue (taille des pores de la membrane de 0,45 m) pour éliminer le colmatage pendant l’injection.
- Assembler un ensemble stérile pour les veines du cuir chevelu (27 G x 3/4") avec une seringue jetable de 3 ml et remplir la seringue avec une solution de bleu de méthylène filtrée de 3 ml.
note: Pour éviter la pression hydrostatique et l’écoulement ultérieur du colorant, placez l’extrémité de l’aiguille au-dessus de la seringue remplie de solution de bleu de méthylène.
2. Dissection d’embryons prénataux
- Nettoyez les ciseaux et les pinces de dissection avec de l’éthanol à 70 %.
- Pour prélever des embryons périnataux à E18.5 ou E19.5, euthanasiez d’abord les souris enceintes en utilisant l’inhalation de CO2, puis effectuez une luxation cervicale conformément aux directives du NIH><.
note: La souris femelle enceinte donne généralement naissance à partir de E18.5, cependant, les reins plus gros sont plus faciles à manipuler. Par conséquent, les reins à E19.5 plus proches de la naissance sont plus faciles à analyser. Cependant, les chiots présentant des obstructions bilatérales des voies urinaires meurent après la naissance. En fonction des caractéristiques des souris expérimentales, un jour/une heure de collecte appropriés doivent être déterminés empiriquement.
- Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la surface abdominale ventrale, puis ouvrez la cavité abdominale ventralement à l’aide de ciseaux de dissection et de pinces.
- Soulevez tout l’utérus et séparez-le du corps en coupant avec des ciseaux de dissection à l’extrémité des cornes utérines.
- Rincez tout l’utérus avec 1x PBS dans une boîte de Pétri.
- Coupez l’utérus segmentairement avec des ciseaux de dissection et retirez les déciduus placentaires avec une pince à dissection pour exposer les embryons dans les sacs vitellins.
- Retirez d’abord le sac vitellin, puis retirez la membrane amniotique à l’aide d’une pince à dissection pour libérer les embryons périnataux.
- Décapitez un embryon avec des ciseaux de dissection. Essuyez l’excès de sang avec des compresses de gaze stériles. Fixez l’embryon avec sa face ventrale vers le haut sur un microscope de dissection équipé d’une caméra numérique pour l’imagerie. Prélever sa queue pour le génotypage si nécessaire.
note: Effectuez des injections un embryon à la fois.
- Ouvrez soigneusement la cavité abdominale d’un embryon à l’aide d’une pince en déchirant la peau. Ensuite, retirez soigneusement les organes et les tissus en excès tels que le foie, l’estomac et l’intestin à l’aide d’une pince en les coupant ou en les tirant pour exposer les reins, les uretères et la vessie qui sont situés dorsalement (Figure 1A). Absorbez l’excès de sang de l’embryon disséqué à l’aide de compresses de gaze stériles si nécessaire.
note: L’excès de sang interfère avec l’identification du bassinet du rein pour l’injection de colorant.
3. Injection de colorant bleu de méthylène dans le bassinet du rein et surveillance de l’écoulement du colorant
- Éliminer les bulles dans l’aiguille et le tube en expulsant la solution de bleu de méthylène de la pointe de l’aiguille par pression hydrostatique. Soulevez la seringue contenant la solution de colorant au-dessus du niveau de la pointe de l’aiguille pour commencer l’écoulement, puis abaissez la seringue pour arrêter l’écoulement.
- Insérez l’aiguille dans le bassinet du rein près de l’uretère proximal, en prenant soin de ne pas la déranger une fois placée. Effectuez l’injection de colorant dans un rein pour déterminer son obstruction des voies urinaires.
note: Effectuez l’injection de colorant dans tout rein anormal, d’abord, en suivant la même méthode pour déterminer son obstruction des voies urinaires.
- Soulevez la seringue d’environ 20 cm pour fournir une pression hydrostatique et laissez couler 15 à 60 μL de la solution de colorant. Le débit sera d’environ 3 μL/s si la seringue est élevée à cette hauteur au-dessus de l’embryon.
- Surveillez la couleur bleue du colorant en commençant d’abord dans le bassinet du rein, puis dans la longueur de l’uretère et enfin dans la lumière de la vessie.
note: Il faut environ 5 s pour voir une couleur de colorant faible émerger dans la lumière de la vessie si l’uretère est correctement inséré dans la vessie. Laissez le colorant s’accumuler au site bloqué environ 15 secondes si aucune couleur de colorant n’apparaît dans la lumière de la vessie.
- Placez la seringue vers le bas pour arrêter l’écoulement du colorant et retirez l’aiguille du rein.
- Prenez des images du rein, de l’uretère et de la vessie tracées avec une solution de colorant à l’aide de la caméra et du programme d’imagerie connectés à un stéréomicroscope.
- Notez l’hydronéphrose du rein, de l’hydrouretère et la position finale de la solution de colorant dans un cahier de laboratoire.
- Effectuer l’injection du rein controlatéral comme décrit aux étapes 3.1 à 3.5 et laisser couler le colorant environ 20 s au total.
note: La lumière de la vessie sera remplie d’une solution de colorant, indiquée par une forte couleur bleue, si l’uretère est correctement inséré dans la lumière de la vessie. Après évaluation de l’obstruction des jonctions urinaires, les uretères et la vessie peuvent être fixés pour la section.