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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Animaux
- Maintenez les souris femelles adultes de 3 à 6 semaines dans une pièce à température et humidité contrôlées (avec des phases de 12L :12D et nourries ad libitum).
- Injectez chez des souris par voie intrapéritonéale 2,5 UI de gonadotrophine sérique de jument enceinte (PMSG) pour stimuler la croissance folliculaire en imitant les effets de l’hormone folliculostimulante (FSH). Isolez les ovaires pour le prélèvement des ovocytes antraux 48 h plus tard. Euthanasier la souris femelle à qui l’on a déjà injecté du PMSG, conformément aux directives standard.
- Retirez rapidement les ovaires de la cavité corporelle et placez-les dans la boîte de Pétri contenant le milieu M2 pour l’isolement ultérieur des ovocytes (voir rubrique 3).
- Faites une incision sur la peau recouvrant la paroi abdominale, suivie d’une incision dans le péritoine à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Ouvrez l’incision pour exposer l’abdomen, déplacez les intestins d’un côté à l’aide d’une pince à épiler stérile et localisez les trompes utérines en formant une forme en V à partir de la vessie.
- Observez les ovaires situés sous les reins. Tenez chaque tube à l’aide d’une pince à épiler stérile et faites une petite incision au bas des ovaires pour les libérer. Transférez les deux ovaires au fond d’une boîte de Pétri contenant un milieu pré-équilibré.
2. Préparation hormonale
- Diluer le PMSG (disponible en différentes concentrations mères) avec une solution saline isotonique stérile pour obtenir une concentration de travail de 2,5 U.I. d’hormone par 0,1 mL pour un volume d’injection approprié.
note: Les solutions hormonales doivent être aliquotes dans des tubes de 0,5 mL et conservées à -20 °C jusqu’au jour de l’utilisation. Ne conservez pas les aliquotes diluées plus de trois mois à -20 °C. Une fois décongelés, si des injections en série sont effectuées, conservez les aliquotes des solutions hormonales à +4 °C et utilisez-les dans les 4 jours.
3. Isolement des ovocytes antraux
Pour une bonne isolation des ovocytes :
- Équilibrez le milieu M2 (M2) à 5 % de CO2 et 37 °C pendant au moins 1 h avant de commencer la procédure d’isolement des ovocytes. Préparez deux boîtes de Pétri (35 mm x 10 mm), l’une avec 1 mL de M2 pour la ponction de l’ovaire et la seconde avec de petites gouttes (20 μL) de M2 recouvertes d’huile minérale (~1,5 mL) pour le transfert des ovocytes après isolement de l’ovaire (voir les étapes 3.4 à 3.6). Conservez les deux boîtes de Pétri dans l’incubateur à 5 % de CO2 et 37 °C jusqu’au moment de les utiliser.
- Utilisez un stéréomicroscope pendant les procédures d’isolement des ovocytes.
- Préparez des pipettes en verre à bouche mince pour recueillir les ovocytes en étirant des pipettes Pasteur en verre maintenues horizontalement (en tenant les extrémités de la pipette à deux mains), au-dessus d’une flamme verticale provenant du bec Bunsen (Figure 1).
- Une fois que le verre commence à fondre, retirez la pipette de la flamme et effectuez un mouvement de traction rapide pour obtenir la pipette souhaitée. Coupez fermement l’excédent de verre près de la pointe étroite de la pipette avec les ongles pour ajuster la longueur et le diamètre du capillaire interne. Assurez-vous que le capillaire mince a un diamètre interne de ~100 μm, légèrement supérieur au diamètre de l'ovocyte (~80 μm).
- Pour pipeter à la bouche, connectez une extrémité du tube de l’aspirateur à la pipette tirée à l’aide d’une pointe appropriée et placez l’autre extrémité dans la bouche, en la fixant avec les dents.
- Prélever les ovaires à l’aide d’une pince à épiler stérile et les déposer au fond d’une boîte de Pétri de culture cellulaire (35 mm x 10 mm). Recouvrez-les de 1 mL de M2 préalablement équilibré à 37 °C et 5 % de CO2 (Figure 2).
- Percer doucement les follicules antraux des ovaires à l’aide d’une aiguille de seringue à insuline stérile pour libérer les ovocytes antraux dans M2 (Figure 3).
- Pipeter doucement les ovocytes à l’aide d’une pipette Pasteur étroite pour prélever les cellules folliculaires et tout autre débris tissulaire éventuel (Figure 4A) puis les déposer au fond de petites gouttes (20 μL) de M2 recouvertes d’huile minérale adaptée à la culture d’embryons (préalablement préparée ; Figure 4B).
note: Il est important d’enlever toutes les cellules du cumulus attachées à la zone pellucide des ovocytes par pipetage continu à travers plusieurs gouttes différentes de M2. Effectuez cette étape le plus rapidement possible pour éviter les altérations du pH du milieu.