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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Injections doubles de résine
- préparation
- Préparez la solution de résine. Pour les injections de résine à double système, préparez les résines jaunes et vertes comme décrit dans les étapes 1.1.2 à 1.1.4.
- Préparez 1 mL d’aliquotes de résine diluée par souris.
- Résine jaune : Diluez le caoutchouc de silicone jaune (radio-opacité élevée) avec le diluant transparent dans une dilution 3:1 pour préparer la résine jaune pour injection.
- Résine verte : Mélangez du caoutchouc de silicone bleu (radio-opacité indétectable) avec le diluant transparent dans une dilution de 1:1 pour préparer de la résine bleue. Pour générer de la résine verte, mélangez la résine bleue diluée avec la résine jaune diluée dans un rapport de 1:1. Mélangez soigneusement la résine verte jusqu’à ce que la couleur soit homogène.
note: La résine bleue a une radio-opacité très faible qui n’est pas détectable avec la microCT, ce qui nécessite donc une dilution avec de la résine jaune pour créer deux résines avec des radio-opacités différentes.
prudence: La résine peut contenir du chromate de plomb, qui est cancérigène. Il produit des gaz toxiques lors d’un incendie. Manipulez avec soin et jetez la résine comme déchet dangereux.
- Préparez deux jeux d’injection (kit d’injection #1 et kit d’injection #2) avec la tubulure comme décrit dans les étapes 1.1.6-1.1.11.
note: Pour les souris adultes (>P30 (30e jour postnatal) = P30 - 2 ans), utilisez le kit d’injection #1 (tube PE10 avec un diamètre extérieur de 0,6 mm) pour l’injection dans le canal cholédoque et le kit d’injection #2 (tube PE50 avec un diamètre extérieur de 0,96 mm) pour l’injection dans la veine porte. Pour les jeunes souris postnatales (jusqu’à P30), préparez deux kits d’injection #1, un pour les canaux biliaires et un pour l’injection dans la veine porte (pas de kit d’injection #2 car la veine porte est trop étroite pour accueillir la tubulure PE50).
- Pour préparer le kit d’injection #1, coupez 30 cm de tube PE10 et étirez une extrémité du tube à la main en le tirant jusqu’à ce qu’il devienne aussi mince que possible (Figure 1A,B, environ 0,15 mm de diamètre, tube PE10 non étiré de 0,6 mm de diamètre).
- Coupez l’extrémité du tube PE10 étiré en diagonale pour créer une pointe biseautée (Figure 1B).
- Connectez l’extrémité non étirée du tube PE10 à une aiguille de 30 G (Figure 1A, kit d’injection #1).
- Pour préparer le kit d’injection #2, coupez 30 cm de tube PE50 et étirez une extrémité du tube à la main en le tirant jusqu’à ce qu’il devienne suffisamment mince pour s’insérer dans la veine porte (Figure 1A,B, environ 0,7 mm, tube PE50 non étiré a un diamètre de 0,96 mm).
- Coupez l’extrémité du tube PE50 étiré en diagonale pour créer une pointe biseautée (Figure 1B).
- Connectez l’extrémité non étirée de la tubulure PE50 à une aiguille 23 G (Figure 1A, kit d’injection #2).
note: Chaque kit d’injection ne peut être utilisé qu’une seule fois car la résine durcit dans la seringue et la tubulure. Ajustez la taille de l’extrémité étirée et biseautée en fonction de la taille du canal cholédoque et de la veine porte de la souris, en fonction de son âge, de son génotype et de son phénotype. Si vous n’êtes pas sûr de la taille et de l’ajustement du tube, insérez-le dans le conduit ou le vaisseau approprié après l’incision et avant que le tube ne soit rempli de résine. Si le tube est trop large pour s’adapter au conduit/récipient, étirez-le davantage.
- Anesthésier l’animal par inhalation d’isoflurane (d’abord 4 % dans la chambre d’induction et ~2 % à l’aide du cône nasal).
- Placez la souris sur un banc ventilé sur un tampon de dissection pendant que la souris respire de l’isoflurane à travers le cône nasal. Vérifiez que l’animal est inconscient à l’aide d’une méthode recommandée par l’institut ou l’IRB, par exemple en pinçant l’une des pattes.
prudence: L’isoflurane peut provoquer de la somnolence ou des étourdissements lors de l’inhalation et peut causer des dommages au système cardiovasculaire et au système nerveux central en cas d’exposition prolongée ou répétée. Ne l’inhalez pas. Manipulez la substance sur un banc ventilé et dans des zones bien ventilées.
note: Il est possible d’utiliser une autre méthode d’anesthésie, à condition qu’elle soit compatible avec la perfusion cardiaque.
- Une fois que l’animal est inconscient, vaporisez la face ventrale avec de l’éthanol à 70 % pour éviter les interférences de la fourrure.
- À l’aide de ciseaux à peau, coupez la peau, le fascia et la couche musculaire en commençant par la ligne médiane de la cavité abdominale et coupez jusqu’à la cavité thoracique pour exposer les organes internes.
- Saisissez le processus xiphoïde avec une pince pour soulever le sternum et coupez le diaphragme et la cage thoracique des deux côtés pour exposer le cœur et les poumons.
- Retirez la cage thoracique en coupant les côtes sur les côtés gauche et droit de la cage thoracique avec des ciseaux. Faites très attention à ne pas endommager le foie, car cela entraînerait une fuite de la résine.
- À l’aide d’une pince droite, tirez le cœur vers le foie et coupez l’oreillette droite.
- Insérez une aiguille papillon (23 G), reliée à une pompe de perfusion péristaltique, dans le ventricule gauche. Perfuser la souris par voie transcardiale avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) et l’héparine (1 U/g du poids corporel de la souris). Perfusion pendant 3 min avec un débit de perfusion de 5 mL/min
note: Si la souris est correctement perfusée, les organes internes deviendront pâles, en particulier le foie. Si, au contraire, les poumons deviennent blancs, l’aiguille est insérée dans le ventricule droit et doit être repositionnée. Après perfusion, la souris est exsangue et peut être retirée du cône nasal et de l’isoflurane.
- Éteignez la pompe à isoflurane.
2. Injection de résine - Coulée de résine du système biliaire
- Déplacez la souris vers le microscope de dissection, l’abdomen vers le haut, la queue vers l’expérimentateur et la tête en vous éloignant de l’expérimentateur. Les points de repère anatomiques d’intérêt sont représentés à la figure 2A.
- Localisez la veine cave inférieure (Figure 2A) en déplaçant l’intestin sur le côté. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une petite incision transversale dans la veine cave inférieure pour permettre la libération de la pression vasculaire hépatique (Figure 2Bi).
- Exposer le canal cholédoque et la veine porte comme décrit aux étapes 1.2.4 à 1.2.6.
- Déplacez l’intestin et le pancréas vers le côté droit (de l’expérimentateur) à l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Retournez la face ventrale du foie vers le cœur à l’aide du coton-tige imbibé de PBS pour exposer la surface viscérale et la région hilaire.
- Localisez le canal cholédoque qui part de la région hilaire à travers le pancréas et pénètre dans l’intestin au niveau du sphincter d’Oddi (Figure 2Bii, le canal cholédoque est délimité par la ligne pointillée jaune, les pointes de flèches noires pointent vers le sphincter d’Oddi).
note: Assurez-vous que le foie est humide tout au long de la procédure en le saupoudrant de PBS.
- Dégager les tissus environnants (zone ~5 mm) du canal cholédoque à l’aide d’une pince droite. Placez du fil de suture en soie (taille 4-0, 0,17 mm, 3-5 cm de long) sous le canal cholédoque (Figure 2Bii) et faites un nœud plat lâche autour du canal cholédoque (Figure 2Biii).
note: Choisissez une zone pour le nœud à mi-chemin entre la région hilaire et le sphincter d’Oddi et à une certaine distance de la veine porte afin qu’une fois la suture resserrée autour du canal cholédoque, elle n’interfère pas avec l’injection de la veine porte.
- Tenez les ciseaux à ressort à plat contre le canal cholédoque pour faire une incision oblique vers le canal cholédoque à l’endroit où le canal cholédoque pénètre dans le pancréas et l’intestin à côté du sphincter d’Oddi. (Figure 2Biv), une ligne pointillée jaune délimite le sphincter de la région d’Oddi, soulignée par des pointes de flèches noires).
note: Il s’agit d’une étape cruciale. Faites une coupe oblique et non transversale, et faites une incision ; Ne sectionnez pas le canal biliaire. La coupe à travers l’ensemble du canal biliaire rend l’insertion du tube très difficile.
- Juste avant l’utilisation, mélangez 1 ml de résine jaune avec 50 μL d’agent de durcissement (en remplissant et en vidant la seringue de 1 mL) et remplissez une seringue Luer de 1 mL avec le mélange de résine et d’agent de durcissement.
- Connectez la seringue remplie avec le tube (ensemble #1). Appuyez sur le piston pour remplir complètement le tube. Assurez-vous que le mélange résine/agent de durcissement s’écoule de l’extrémité du tube.
note: Évitez et éliminez les bulles dans la seringue et le tube pour de meilleurs résultats.
- À l’aide d’une pince, redressez la zone autour de l’incision du canal cholédoque et insérez le tube dans l’ouverture du canal cholédoque (Figure 2Bv), avec le bord le plus long de l’extrémité biseautée vers le bas vers la face dorsale du canal biliaire. Cette orientation permet à la résine de sortir de l’ouverture du tube, qui est orientée vers le haut, dans le conduit (Figure 2Bv).
- Serrez le nœud du fil de soie pour fixer le tube à l’intérieur du canal cholédoque (Figure 2Bvi).
- Injectez la résine dans le canal cholédoque. Observez la vésicule biliaire et les lobes hépatiques individuels.
- Massez le foie avec un coton-tige imbibé de PBS pour aider à répartir uniformément la résine. Les branches terminales des voies biliaires remplies de résine (chez les souris de type sauvage) sont faiblement visibles à la surface du foie.
note: Le temps prévu pour remplir le foie est de 30 à 100 s.
- Arrêtez d’injecter la résine lorsque des points de résine apparaissent à la surface du foie (Figure 2Ci, pointes de flèches bleues) ou lorsque la résistance est rencontrée.
note: Travaillez aussi vite que possible car la résine commence à durcir après l’ajout de l’agent de durcissement de la résine. Le temps de travail à partir de l’ajout de l’agent de durcissement est d’environ 15 min.
- Retirez le tube en le retirant du canal cholédoque et serrez rapidement le nœud de soie à l’aide d’une pince pour éviter que la résine ne s’échappe. Coupez les extrémités libres de la suture en soie, afin qu’elles n’interfèrent pas avec l’injection de la veine porte.
- Jetez le tube contenant la résine et la résine restante dans les déchets dangereux et l’aiguille dans les déchets tranchants.
