Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des systèmes de perfusion par pompe micro-osmotique
REMARQUE : Préparez la pompe, le tampon de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) et le médicament (solution protéique Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL dans aCSF)) dans des conditions stériles à l’aide de tampons filtrés avec des filtres de 0,2 μm et effectuez toutes les procédures sous le capot de culture avec des gants. Les procédures chirurgicales se déroulent comme suit :
- Préparez les pompes micro-osmotiques un jour avant l’intervention chirurgicale : Remplissez la pompe micro-osmotique cérébrale avec du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) avec une seringue de 1 ml et une aiguille à tête émoussée fournies avec le kit. Plongez la pompe micro-osmotique dans un LCR et placez-la sur un agitateur et secouez-la doucement pendant la nuit.
ATTENTION : La pompe doit être remplie d’aCSF et les bulles d’air doivent être évitées à l’intérieur de la pompe (Figure 1A).
- Avant de commencer l’intervention chirurgicale, préparer la solution recombinante de la protéine Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluée dans un LCR) à utiliser dans l’expérience. Retirez l’aCSF de la pompe et remplissez lentement la pompe avec la solution médicamenteuse jusqu’à ce que l’excès s’échappe.
REMARQUE : 15 mL de solution aCSF ou Met-CCL5/RANTES sont suffisants pour 5 à 8 pompes.
ATTENTION : Répétez la procédure pour vous assurer que la pompe est complètement remplie avec le médicament sans bulles à l’intérieur.
- Coupez les tubes du cathéter à la longueur souhaitée et fixez-les avec l’aiguille de perfusion cérébrale à extrémité émoussée dans le kit de perfusion cérébrale. Remplissez le kit de perfusion et les tubes avec le médicament.
- Enfin, assemblez et fixez le kit de perfusion cérébrale à la pompe micro-osmotique.
ATTENTION : Aucune bulle ne doit se former dans le tube ou la pompe (Figure 1A).
- Immergez l’ensemble de la fusion osmotique-cerveau dans un tube stérilisé de 50 mL pour éviter que la pompe ne se dessèche. Le kit de fusion osmotique-cerveau est maintenant prêt à être utilisé pour la chirurgie.
REMARQUE : Les systèmes de pompe micro-osmotique peuvent être utilisés pour la perfusion de médicaments à long terme. Cela garantit un mode sûr et pratique d’administration du médicament dans le cerveau de la souris.
2. Chirurgie ventriculaire intracérébrale – implantation de la pompe micro-osmotique
ATTENTION : Stérilisez l’environnement chirurgical avec de l’éthanol à 75 % et assurez-vous que les personnes impliquées dans l’étude portent des gants stériles et une blouse de laboratoire propre. Les outils et instruments chirurgicaux doivent être autoclavés et séchés avant d’être utilisés, puis stérilisés avec de l’éthanol à 75 % entre les chirurgies de souris.
- Pesez la souris et anesthésiez-la à l’aide d’une injection intra-péritonéale (IP) avec de la kétamine/xylazine (kétamine 50 mg/kg, xylazine 10 mg/kg).
ATTENTION : Le poids corporel des souris inférieur à 24 g n’est pas recommandé pour la chirurgie d’implantation de pompe osmotique.
- Montez et fixez la tête de la souris sur l’appareil stéréotaxique (Figure 1B).
- Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux et de pinces pour ouvrir la peau externe recouvrant le crâne. Utilisez de l’iode pour nettoyer le crâne périphérique.
- Séparez la couche la plus externe de la peau sous-cutanée à l’aide d’une paire de pinces à tête émoussée près de la région du cou pour l’implantation de l’ensemble de fusion osmotique-cerveau (Figure 1C).
- Marquez le point de perfusion par rapport à la carte cérébrale (Figure 1D) à l’aide de l’appareil stéréotaxique. Dans cette expérience, l’aiguille doit être implantée dans la 3e région du ventricule (Bregma : 0,0 mm latéral, 1,3 mm postérieur, 5,7 mm ventral).
- Percez un trou à l’aide d’une perceuse à ongles autour de la zone marquée sur le crâne (Figure 1E).
ATTENTION : Veillez à ne pas casser les méninges et les vaisseaux sanguins de la souris, évitant ainsi la perturbation des micro-vaisseaux sanguins dans le cerveau.
- Placez l’ensemble de fusion micro-osmotique pompe-cerveau contenant un LCR (comme témoin) ou un médicament (solution protéique Met-CCL5/RANTES) sous la peau derrière la région du cou et insérez l’aiguille de perfusion cérébrale dans le trou percé pour infuser le médicament dans le cerveau de la souris (Figure 1E). L’aiguille pénétrera dans les méninges et pénétrera dans le ventricule. Fixez l’aiguille en place sur le crâne à l’aide d’un gel désensibilisant de surface (Figure 1F) et attendez 1 à 2 minutes jusqu’à ce que la colle sèche. Ensuite, coupez la partie saillante au-dessus de l’aiguille (Figure 1G-H).
- Utilisez une colle adhésive pour tissus pour cicatriser la plaie de l’opération sur la tête. Appliquez 50 μL de colle sur le dessus de la plaie, rapprochez les deux côtés de la peau et maintenez pendant 30 s pour permettre à la peau de se sceller (Figure 1I).
ATTENTION : Utilisez un tampon d’alcool à 100 % pour nettoyer la plaie après la chirurgie et 100 ul de pénicilline avec de la streptomycine pour prévenir l’infection. REMARQUE : La peau de souris formera du tissu cicatriciel et guérira en quelques jours après l’administration de la colle chirurgicale. Le principal avantage de la colle est d’éviter les points de suture chirurgicaux qui peuvent provoquer une irritation ou une inflammation de la peau.
- Placez la souris dans une cage propre maintenue sur une plaque chaude (chauffée à 37 °C) et attendez que la souris se remette de l’effet anesthésique.
ATTENTION : Il est essentiel de maintenir la température corporelle de la souris pour augmenter les chances de survie après la chirurgie.
- Après une période de récupération d’une semaine, les souris seront prêtes pour d’autres expériences, telles que le test de tolérance au glucose oral (OGTT) et le test de tolérance à l’insuline (ITT).
