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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des souris et insertion d’un cathéter dans la veine jugulaire
NOTE : Ici, des souris rapporteures mTmG mâles ou femelles âgées de 5 à 7 semaines ont été utilisées (B6.129(Cg) Gt(ROSA)26Sortm4(ACTBtdTomato,-EGFP)Luo10) croisées avec des souris Pf4-cre, permettant un marquage en fluorescence verte intense dans les mégacaryocytes et les plaquettes. Avant de commencer l’expérience, préchauffez la chambre de chauffe du microscope pendant quelques heures.
- Transportez la souris jusqu’à la salle d’imagerie et procédez à l’anesthésie.
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution de kétamine (kétamine (100 μg/g) et xylazine (10 μg/g) (5 μL/g).
note: L’administration répétée de kétamine/xylazine est utilisée ici et fonctionne bien, mais nécessite l’interruption de l’enregistrement pour une réinjection régulière. Alternativement, si un appareil d’anesthésie est disponible, l’induction de l’anesthésie peut être effectuée avec de la kétamine/xylazine et ensuite maintenue sous inhalation de gaz (mélange d’isoflurane, d’air et d’oxygène).
- Replacez l’animal dans sa cage jusqu’à ce qu’il atteigne une anesthésie profonde. Placez la souris sur une plaque chauffante chauffée à 37 °C pour toutes les manipulations ultérieures.
note: Pendant que l’animal atteint une anesthésie profonde, allumez le microscope et tout l’équipement et configurez les différents paramètres nécessaires pour démarrer l’expérience une fois l’opération terminée. Ici, la procédure ne dure que 3 h et est terminale. La souris est euthanasiée après l’expérience sans se réveiller. Par conséquent, la désinfection à l’éthanol de la peau et des instruments est suffisante. Cependant, en fonction des directives de l’établissement, ou si la procédure durerait plus longtemps, des méthodes de désinfection plus complètes devraient être utilisées, telles que trois gommages alternés avec de la bétadine/povidone et de l’alcool.
2. Installez un cathéter dans la veine jugulaire.
REMARQUE : Il est important d’éviter autant que possible la contamination microbienne pendant l’opération. Prenez soin de désinfecter soigneusement la peau avec de l’éthanol à 70 % (EtOH) avant de procéder à l’opération. Utilisez toujours des ciseaux et une pince à épiler stérilisés et rincez-les régulièrement à 70 % d’EtOH. Travaillez dans un endroit propre et portez un masque facial. Un cathéter « sur l’aiguille » de 22 G, composé d’une aiguille à l’intérieur d’un tube en plastique, est utilisé pour l’injection intraveineuse (voir le tableau des matériaux).
- Placez la souris sur son dos et fixez les pattes antérieures à l’aide d’un ruban chirurgical pour étirer la gorge (Figure 1A). Désinfectez la gorge avec de l’éthanol à 70 %.
note: Pour plus de commodité, la gorge peut être rasée avant la chirurgie. Si la procédure dure plus longtemps, un rasage soigneux doit être effectué pour une technique d’asepsie appropriée.
- Faites une incision de 0,7 à 1 cm sur la veine jugulaire droite ou gauche à l’aide de ciseaux stériles. Étirez le tissu conjonctif adjacent pour exposer la veine jugulaire externe et le haut du muscle pectoral (Figure 1A).
- Remplissez le cathéter avec une solution saline physiologique chaude et stérile. Insérez le cathéter dans la veine après avoir pénétré dans le muscle pectoral (Figure 1B).
note: Prenez soin d’éviter les bulles d’air à l’intérieur du cathéter. Il est important d’insérer le cathéter à travers le muscle pour éviter l’hémorragie, car le muscle formera un point de compression. Même les souris présentant des défauts d’hémostase, telles que les souris Itgb3-/-, ne saignent pas lors de l’insertion du cathéter avec cette approche.
- Retirez doucement l’aiguille et, si nécessaire, déplacez soigneusement le cathéter plus profondément dans la veine. Connectez la seringue et stabilisez le cathéter en ajoutant une goutte de colle chirurgicale (Table des matériaux).
note: Il est possible d’insérer un cathéter à l’intérieur de la veine de la queue, bien que cela nécessite un peu de pratique car la veine a un calibre plus petit. Ceci est particulièrement difficile lorsque vous utilisez des souris aux poils foncés, dont la veine de la queue est à peine visible. En raison de son calibre plus important, le positionnement du cathéter à l’intérieur de la veine jugulaire peut permettre d’injecter de plus grands volumes ou des traitements répétés de manière plus fiable. Veuillez noter que la seringue est remplie une première fois d’une solution saline chaude, et n’oubliez pas d’injecter le volume mort avant d’injecter la solution médicamenteuse.
- Remettez délicatement la souris en position couchée (Figure 1C). Appliquez du gel (Table des matériaux) sur les yeux pour prévenir le dessèchement.
