Imagerie intravitale : méthode d’observation cellulaire du pancréas de souris à travers une fenêtre d’imagerie stabilisée

Résumé

Source : Park, I. et Kim, P. Visualisation longitudinale stabilisée in vivo au niveau cellulaire du pancréas dans un modèle murin avec une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous décrivons l’imagerie intravitale d’un pancréas de souris à travers une fenêtre stabilisée pour la visualisation à long terme de la dynamique cellulaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Imagerie intravitale

1. Allumez le microscope intravital, y compris la puissance laser.
2. Allumez le coussin chauffant et réglez la régulation homéothermique sur 37 °C.
   note: Alternativement, utilisez un coussin chauffant passif ou une lampe avec contrôle fréquent s’il n’y a pas de régulation homéothermique.
3. Prenez une souris avec une fenêtre pancréatique pré-implantée. Effectuer une anesthésie intramusculaire avec un mélange de tilétamine/zolazépam (30 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
   note: L’utilisation de tilétamine/zolazépam est recommandée à la place de la kétamine en raison de son effet indésirable d’hyperglycémie. L’anesthésie optimale doit être choisie pour les besoins des expériences.
4. Insérez un cathéter vasculaire pour l’injection.
   1. Appliquez une pression sur le côté proximal de la queue avec l’index et le troisième doigt comme alternative à l’application d’un garrot. Chauffez la queue avec une lampe si nécessaire.
   2. Stérilisez la veine de la queue avec un spray à 70 % d’éthanol.
   3. Insérez un cathéter de 30 G dans la veine latérale de la queue. La régurgitation de sang sera visualisée dans le tube PE10.
   4. Appliquez un ruban de soie sur le cathéter pour le stabiliser.
   5. Injecter du dextran FITC/TMR ou d’autres sondes fluorescentes (25 μg d’anti-CD31 conjugués à Alexa 647), selon le cas, selon la combinaison de sondes fluorescentes.
      note: Pour les sondes d’anticorps conjugués fluorescents, injecter 2 h avant la séance d’imagerie.
5. Transférez la souris de la plate-forme chirurgicale à la scène d’imagerie.
6. Insérez une sonde rectale pour contrôler automatiquement la température corporelle avec le système de coussin chauffant homéothermique.
7. Insérez la fenêtre d’imagerie pancréatique dans le support de fenêtre préparé lors de la configuration de la microscopie intravitale (Figure 1). Pour un microscope inversé, un support de fenêtre peut ne pas être nécessaire.
8. Effectuer l’imagerie intravitale.
   1. Pour l’imagerie du pancréas, commencez avec une lentille d’objectif à faible grossissement (par exemple, 4x) pour balayer toute la vue du pancréas dans la fenêtre d’imagerie pancréatique (champ de vision recommandé : 2500 x 2500 μm).
   2. Après avoir déterminé la région d’intérêt, passez à une lentille d’objectif à fort grossissement (20x ou 40x) pour effectuer l’imagerie au niveau cellulaire (champ de vision recommandé : 500 x 500 μm ou 250 x 250 μm). Dans cette expérience, la résolution latérale et axiale était d’environ 0,5 μm et 3 μm, respectivement.
   3. Effectuez une imagerie z-stack ou time-lapse pour observer la structure 3D ou la dynamique au niveau cellulaire, telle que la migration cellulaire.
      note: Pour l’imagerie des cellules exprimant des protéines fluorescentes d’animaux transgéniques (MIP-GFP), 30 s d’exposition intermittente au laser de 488 nm avec une puissance allant jusqu’à 0,43 mW étaient tolérables sans photoblanchiment notable ni lésion tissulaire. Pour l’imagerie des protéines fluorescentes marquées avec Alexa 647, la puissance laser de 640 nm jusqu’à 0,17 mW était tolérable sans photoblanchiment notable ni lésion tissulaire. Une exposition prolongée au laser d’excitation avec une puissance supérieure à ce réglage peut entraîner un photoblanchiment ou des lésions tissulaires par phototoxicité. Ajustez le gain et la puissance adéquats pour imager correctement la région d’intérêt. Le réglage détaillé des paramètres en microscopie intravitale doit être individualisé pour chaque microscopie intravitale préparée dans l’institut.

Résultats

Figure 1 : Photographie de la mise en œuvre de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.Une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique est implantée dans la souris dans l’étape de translation XYZ et le support de chambre d’imagerie fixé à la monture inclinable est connecté à la fenêtre d’imagerie pancréatique. Copyright 2020 Association coréenne du diabète de Diabetes Metab J. 2020 44:1...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 647 Esters succinimidyliques (esters NHS)	Invitrogen	A20006	Sonde fluorescente pour conjugué avec anticorps
Tubes en polyéthylène BD Intramedic	BD Biosciences	427401	Cathéter PE10 pour la connexion avec l’aiguille
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Verres de couverture circulaires	Marienfeld	0111520	Verre de protection pour fenêtre d’imagerie pancréatique
FITC Dextran 2MDa	Merck (Ancien Sigma Aldrich)	FD200S	Pour l’identification du navire
IMARIS 8.1	Plan binaire	IMARIS	traitement d'images
Microscopie intravitale	La technologie IVIM	IVM-C	Microscopie intravitale
MIP-GFP	Le Laboratoire Jackson	006864	N° B6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Fenêtre d’imagerie pancréatique	Geumto Engineering	Commande personnalisée	Fenêtre d’imagerie pancréatique - commande personnalisée
Physiosuite	Kent Scientific	PS-02	Régulateur de température homéothermique
RTM Dextran 65-85kDa	Merck (Ancien Sigma Aldrich)	Réf. T1162	Pour l’identification du navire
Support de fenêtre	Geumto Engineering	Commande personnalisée	Support de fenêtre - commande sur mesure
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Agent anesthésique
Rompun	Bayer	Rompun	Agent anesthésique