Modèle de perfusion antérograde : une technique ex vivo pour perfuser le cœur isolé d’une souris

Résumé

Source : Omatsu-Kanbe, M. et al., An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit une technique de perfusion antérograde d’un cœur de souris isolé au cours de laquelle un perfusat est injecté à travers le ventricule gauche, et finalement, il perfore tout le myocarde. Cette méthode peut être utilisée pour isoler des cardiomyocytes à partir de modèles murins et générer des cœurs décellularisés pour d’autres applications en aval.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Perfusion antérograde du cœur de souris

REMARQUE : La pipette de transfert en plastique utilisée pour sucer le cœur doit être souple et ne pas être fortement effilée vers la pointe. Choisissez une petite pince vasculaire avec dentelure. Les instruments recommandés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Excision du cœur de souris et clampage de l’aorte
   note: Les souris adultes (âgées de >8 semaines) doivent être euthanasiées par une surdose de pentobarbital sodique (>300 mg/kg, injection intrapéritonéale) et d’héparine (8000 unités/kg).
   1. Excise rapidement le cœur de la souris en suçant.
      1. Ouvrez rapidement la cavité thoracique pour exposer le cœur. Coupez la pipette de transfert en plastique, dont l’extrémité est à peu près de la même taille ou légèrement plus petite que le cœur exposé (généralement à un endroit situé à environ 1 cm de la marque de 0,5 mL vers la pointe, mais cela dépend de la taille du cœur).
      2. Aspirez le cœur dans la pipette, soulevez la pipette pour créer suffisamment d’espace pour insérer des ciseaux, et excisez le cœur avec des ciseaux incurvés du côté dorsal, en évitant d’endommager les oreillettes.
      3. Transférez immédiatement le cœur excisé dans le bécher en verre de 30 ml contenant du CIB-EGTA glacé pour arrêter la contraction. Cette procédure prend généralement <1 min.
   2. Nettoyage autour de l’aorte
      1. Transférez le cœur dans une boîte de culture de 35 mm remplie de CIB-EGTA glacé et retirez le poumon et les autres tissus visibles, puis transférez le cœur grossièrement nettoyé dans le support de cœur rempli de CIB-EGTA réfrigéré et placez-le avec l’apex vers le bas.
      2. Au microscope stéréoscopique, retirez la graisse et les tissus conjonctifs pour nettoyer autour de l’aorte. Si la longueur de l’aorte coupée est trop longue, y compris l’artère brachiocéphale, l’artère carotide commune gauche ou l’artère sous-clavière gauche, coupez l’aorte juste en dessous de l’artère brachiocéphalique pour la raccourcir afin de passer à l’étape suivante. Cette procédure prend généralement environ 4 minutes
   3. Clampage de l’aorte et placement du cœur clampé sur la plaque de perfusion
      1. Insérez l’aiguille d’injection et démarrez la perfusion pour évacuer le sang
         1. Sous le microscope, placez le cœur dans le support cardiaque. L’opérateur doit faire face à la surface antérieure du cœur, saisir l’extrémité de l’aorte à l’aide d’une pince à épiler et serrer l’aorte près des oreillettes à l’aide d’une petite pince vasculaire tout en appuyant doucement sur l’aorte.
         2. Placez le cœur clampé sur la plaque de perfusion avec la face antérieure vers le haut, puis couvrez-le de quelques gouttes de CIB-EGTA pour l’empêcher de se dessécher. Cette procédure prend généralement <20 s.
      2. Perfusion antérograde du cœur
         note: Tout d’abord, perfuser le cœur avec CIB-EGTA pour évacuer le sang et prévenir la coagulation.
         1. Insérez l’aiguille d’injection et démarrez la perfusion pour évacuer le sang
            1. Placez la seringue de 20 mL remplie de CIB-EGTA préchauffé connectée au tube d’extension flexible et à une aiguille d’injection marquée sur la pompe à perfusion. Démarrez la pompe à un débit lent de 0,5 mL/min pour remplir soigneusement l’aiguille et le tube avec CIB-EGTA et assurez-vous d’empêcher tout air de pénétrer dans le tube.
            2. Placez l’aiguille d’injection sur la plaque de perfusion avec le côté le plus court de la forme diagonale à l’avant. Faites glisser l’aiguille vers l’apex du cœur jusqu’à ce qu’elle le touche, puis insérez soigneusement l’aiguille près de l’apex du ventricule gauche dans la chambre ventriculaire sans la tordre. Ne détachez pas l’aiguille de la plaque pendant l’insertion.
            3. Surveillez la marque rouge pour estimer la profondeur d’insertion de l’aiguille. Lorsque l’insertion de l’aiguille est terminée, le sang qui s’écoule de l’artère coronaire devrait commencer à s’écouler.
            4. Fixez l’aiguille d’injection sur la plaque à l’aide de ruban adhésif et augmentez la vitesse de la pompe à 1 mL/min. Cette procédure prend généralement environ 30 s. Si le cœur est perfusé avec succès, le flux de CIB-EGTA dans le capillaire juste sous l’épicarde peut être observé au microscope.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube d’extension	Haut, Japon	X1 à 50	Connectez-vous avec la seringue et l’aiguille d’injection pour une perfusion antérograde.
Tapis chauffant	Natsume Seisakusho, Japon	KN-475-3-40	Équipement pour réchauffer la plaque de perfusion.
Pompe à perfusion	TERUMO, Japon	TE-311	Pousse-seringue à perfusion pour perfusion antérograde.
Aiguille d’injection (calibre 27)	TERUMO, Japon	NN-2719S	Aiguille pour l’insertion dans le ventricule gauche.
Insuline (à partir du pancre bovin)	Sigma-Aldrich, États-Unis	I5500	Dissoudre dans 0,1 M HCl.
Seringue en plastique (20 mL)	TERUMO, Japon	SS-20ES	Utilisation pour la perfusion de CIB-EGTA.
Pince vasculaire	Karl Hammacher GmbH, Allemagne	HSE 004-35	Petite pince vasculaire droite utilisée pour le clampage de l’aorte.
Tous les autres réactifs	Nacalai Tesque, Japon