Fixation par pression d’une valve pulmonaire murine isolée : une procédure pour isoler et fixer chimiquement la valve pulmonaire de souris en conformation fermée

Résumé

Source : Liu, Y., et al. Chirurgie et traitement d’échantillons pour l’imagerie corrélative de la valve pulmonaire murine. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’isolement et de fixation chimique de la valeur pulmonaire de la souris en conformation fermée par pressurisation par perfusion.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Excision valvulaire pulmonaire

1. Autoclave les outils nécessaires à la dissection de la souris. Cela comprend des ciseaux fins, des micro-pinces, des micro-pinces vasculaires, des pinces d’application de pinces, des porte-micro-aiguilles, des ciseaux à ressort et des écarteurs.
2. Acclimatez toutes les souris pendant au moins 2 semaines avant l’opération. Retirer les souris C57BL/6, âgées d’environ 1 an, de leur cage et les peser, puis les euthanasier avec un cocktail kétamine/xylazine (3:1 kétamine :xylazine, 0,01 mL par g) en surdose.
3. Placez la souris en position couchée dorsale sur un plateau et fixez ses membres avec du ruban adhésif. Une fois sécurisé, effectuez la thoracotomie.
   1. Exposez le cœur en enlevant tout excès de tissu adipeux et de fascia.
   2. Retirer l’oreillette droite et perfuser à travers le ventricule gauche avec une solution saline à température ambiante (0,9 % de NaCl). La perfusion devrait prendre environ 20 ml sur 30 s. Il en résulte l’exsanguination de la souris.
4. Enlevez tout le cœur en sectionnant la veine cave supérieure, la veine cave inférieure, l’artère pulmonaire et l’aorte. Une attention particulière doit être portée à l’artère pulmonaire. Coupez à environ 2 mm au-dessus de la jonction ventricule artérielle, car elle servira de conduit pour la pressurisation.
5. Retirez les ventricules gauche et droit pour exposer les chambres à la pression atmosphérique. Assurez-vous que la structure du tronc pulmonaire ne doit pas être affectée par l’ablation des ventricules.

2. Fixation de la pression de la valve pulmonaire

1. Tubulure de pressurisation anastomose avec artère pulmonaire, laissant une distance d’environ 1 mm entre la jonction sino-tubulaire et l’extrémité de la tubulure pour s’adapter aux mouvements importants des feuillets et du tronc pulmonaire.
2. Élevez le réservoir à une pression physiologique analogue et remplissez-le de solution saline. Testez le système de circulation pour vous assurer qu’il n’y a pas de blocages ou de bulles d’air.
3. Fixez un robinet d’arrêt à la valve pulmonaire anastomosée et assurez-vous qu’un débit adéquat dans le tube (c’est-à-dire pas de bulles d’air) en changeant la voie d’évacuation. Une fois que le débit est adéquat, basculez l’écoulement sur la valve pulmonaire anastomosée et assurez la pressurisation du tronc pulmonaire. Ceci est identifié par la distension du tronc pulmonaire.
4. Une fois la pressurisation du tronc pulmonaire confirmée, incorporer progressivement la solution fixatrice primaire (1,25 % de glutaraldéhyde, 1,0 % de paraformaldéhyde dans du cacodylate de 0,15 M) jusqu’à ce que la solution saline soit purgée. Pour ce faire, on retire une partie, soit environ 25 % de la capacité du réservoir, de la solution saline et on la remplace par le fixateur primaire.
   prudence: Les fixateurs utilisés (paraformaldéhyde et glutaraldéhyde) sont hautement toxiques et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté pour assurer la sécurité.
5. Placez une gaze imbibée de fixateur sur l’échantillon de tissu pour éviter le dessèchement.
6. Perfuser le fixateur pendant 3 h, en remplissant le réservoir au besoin pour maintenir une pression constante. Tout au long de la fixation, il n’est pas rare que la valve pulmonaire rétrécisse en raison de la fixation chimique. Si tel est le cas, remplissez constamment le réservoir avec un fixateur primaire pour maintenir la pression physiologique.
7. Conservez la valve cardiaque dans la solution fixatrice à 4 °C jusqu’à utilisation. Les échantillons ont été conservés jusqu’à 1 semaine sans aucune différence perceptible.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
25 % de glutaraldéhyde (aq)	Ems	Référence 16210	Composant fixateur primaire
Chlorure de sodium injectable à 0,9 %	Hospira inc.	NDC 0409-4888-10
Seringue de 1 mL	Bd	309659
Seringue de 10 mL	Bd	309604
Aiguille 22G	Bd	305156
Robinet d’arrêt à 3 voies	Smiths Medical ASD, Inc	MX5311L
4 % de paraformaldéhyde (aq)	Ems	Référence 157-4-100	Composant fixateur primaire
C57BL/6 souris	Laboratoires Jackson	664	Environ 1 an
Pince d’application de la pince	Le	Référence 00072-14
Pince Dumont #5	Le	Référence 11251-20
Pince Dumont #5/45	Le	Référence 11251-35
Pince fine Dumont #7	Le	Référence 11274-20
Ciseaux fins	Le	Référence 14028-10
Solution saline (chlorure de sodium stérile à 0,9 %)	Hospira Inc	NDC 0409-0138-22
Microscope chirurgical	Leica	M80
Porte-aiguille/pince Tish	Micrins	MI1540 (en anglais
Tondeuse	Wahl	Référence 9854-500
Suture monofilament polyamide noir, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Suture monofilament polyamide noir, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
Injection de chlorhydrate de kétamine	Hospira Inc	NDC 0409-2053
Acide L-aspartique	Sigma-Aldrich	Référence 56-84-8	Composant de coloration
Nitrate de plomb	Ems	N° 17900	Composant de coloration
Cacodylate de sodium trihydraté	Sigma-Aldrich	Référence 6131-99-3	tampon
Chansons non tissées	McKesson Corp.	Référence 94442000
Pince micro-adson	Le	Référence 11018-12
Filtre Millex-GP, 0,22 um, PES 33mm, non stérile	EMD Millipore	SLGP033NS

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