Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Excision valvulaire pulmonaire
- Autoclave les outils nécessaires à la dissection de la souris. Cela comprend des ciseaux fins, des micro-pinces, des micro-pinces vasculaires, des pinces d’application de pinces, des porte-micro-aiguilles, des ciseaux à ressort et des écarteurs.
- Acclimatez toutes les souris pendant au moins 2 semaines avant l’opération. Retirer les souris C57BL/6, âgées d’environ 1 an, de leur cage et les peser, puis les euthanasier avec un cocktail kétamine/xylazine (3:1 kétamine :xylazine, 0,01 mL par g) en surdose.
- Placez la souris en position couchée dorsale sur un plateau et fixez ses membres avec du ruban adhésif. Une fois sécurisé, effectuez la thoracotomie.
- Exposez le cœur en enlevant tout excès de tissu adipeux et de fascia.
- Retirer l’oreillette droite et perfuser à travers le ventricule gauche avec une solution saline à température ambiante (0,9 % de NaCl). La perfusion devrait prendre environ 20 ml sur 30 s. Il en résulte l’exsanguination de la souris.
- Enlevez tout le cœur en sectionnant la veine cave supérieure, la veine cave inférieure, l’artère pulmonaire et l’aorte. Une attention particulière doit être portée à l’artère pulmonaire. Coupez à environ 2 mm au-dessus de la jonction ventricule artérielle, car elle servira de conduit pour la pressurisation.
- Retirez les ventricules gauche et droit pour exposer les chambres à la pression atmosphérique. Assurez-vous que la structure du tronc pulmonaire ne doit pas être affectée par l’ablation des ventricules.
2. Fixation de la pression de la valve pulmonaire
- Tubulure de pressurisation anastomose avec artère pulmonaire, laissant une distance d’environ 1 mm entre la jonction sino-tubulaire et l’extrémité de la tubulure pour s’adapter aux mouvements importants des feuillets et du tronc pulmonaire.
- Élevez le réservoir à une pression physiologique analogue et remplissez-le de solution saline. Testez le système de circulation pour vous assurer qu’il n’y a pas de blocages ou de bulles d’air.
- Fixez un robinet d’arrêt à la valve pulmonaire anastomosée et assurez-vous qu’un débit adéquat dans le tube (c’est-à-dire pas de bulles d’air) en changeant la voie d’évacuation. Une fois que le débit est adéquat, basculez l’écoulement sur la valve pulmonaire anastomosée et assurez la pressurisation du tronc pulmonaire. Ceci est identifié par la distension du tronc pulmonaire.
- Une fois la pressurisation du tronc pulmonaire confirmée, incorporer progressivement la solution fixatrice primaire (1,25 % de glutaraldéhyde, 1,0 % de paraformaldéhyde dans du cacodylate de 0,15 M) jusqu’à ce que la solution saline soit purgée. Pour ce faire, on retire une partie, soit environ 25 % de la capacité du réservoir, de la solution saline et on la remplace par le fixateur primaire.
prudence: Les fixateurs utilisés (paraformaldéhyde et glutaraldéhyde) sont hautement toxiques et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté pour assurer la sécurité.
- Placez une gaze imbibée de fixateur sur l’échantillon de tissu pour éviter le dessèchement.
- Perfuser le fixateur pendant 3 h, en remplissant le réservoir au besoin pour maintenir une pression constante. Tout au long de la fixation, il n’est pas rare que la valve pulmonaire rétrécisse en raison de la fixation chimique. Si tel est le cas, remplissez constamment le réservoir avec un fixateur primaire pour maintenir la pression physiologique.
- Conservez la valve cardiaque dans la solution fixatrice à 4 °C jusqu’à utilisation. Les échantillons ont été conservés jusqu’à 1 semaine sans aucune différence perceptible.