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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation du matériel et des instruments
- Connectez la couverture chauffante pour maintenir la température de la zone d’opération et la température du corps de la souris pendant l’anesthésie à 37 °C.
- Autoclavez les ciseaux et les pinces, préparez une solution d’éthanol à 70 % et gardez à disposition une pommade oculaire au dexpanthénol, plusieurs morceaux de coton et une suture en polyester tressé enduit 5-0 prête à l’emploi. Préparez une seringue de 1 mL avec une solution saline à 0,9 % (sans aiguille) pour garder le site d'incision de l'animal hydraté. Préparez le gaz d’anesthésie (100 % O2 + isoflurane).
- Préparez un support pour la sonde laser Doppler en coupant l’extrémité d’une pointe de pipette de 10 μL (longueur 3-5 mm).|
REMARQUE : Tous les instruments sont stérilisés à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes. Les surfaces sont également désinfectées avant et après l’opération avec un spray désinfectant microbien. Avant l’intervention chirurgicale, les zones entourant la tête et la poitrine des souris sont désinfectées à l’aide d’un spray désinfectant pour les plaies.
2. Préparation du laser Doppler
- Injecter un analgésique à la souris 30 min avant l’intervention (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine, par voie intrapéritonéale).
- Anesthésier la souris en la plaçant dans la chambre d’induction avec un débit d’isoflurane de 4 % jusqu’à l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
- Placez la souris en position couchée dans la zone d’opération, le nez dans le masque d’anesthésie. Maintenez la concentration d’isoflurane à 4 % pendant une minute supplémentaire, puis réduisez-la et maintenez-la à 2 %.
- Réglez le coussin chauffant associé contrôlé par rétroaction pour maintenir la température du corps de la souris à 37 °C et insérez doucement la sonde rectale pour surveiller la température tout au long des procédures chirurgicales.
- Appliquez la pommade oculaire au dexpanthénol sur les deux yeux.
- Désinfectez la peau et les cheveux entourant l’œil gauche et l’oreille avec de l’éthanol à 70 %.
- Coupez le cuir chevelu entre l’oreille gauche et l’œil (1 cm de long) pour exposer l’os du crâne.
- Coupez et retirez le muscle temporal pour visualiser le MCA sous le crâne.
- Fixez avec de la colle la partie extérieure de la pointe en maintenant la sonde laser Doppler/fibre sur le dessus du MCA gauche avec de la colle. Ensuite, collez la peau pour fermer la plaie autour du porte-pointe. Appliquez 2-3 gouttes de colle durcissante pour accélérer le processus. Assurez-vous que la fibre laser Doppler n’est pas collée et qu’elle peut être facilement retirée du porte-pointe à tout moment.
3.Modèle MCAo transitoire (occlusion)
- Tournez la souris en position couchée. Insérez le museau dans le cône d’anesthésie et fixez les pattes avec du ruban adhésif.
- Désinfectez la peau et les cheveux entourant la poitrine et faites une incision médiane de 2 cm de long dans le cou.
- À l’aide d’une pince, séparez la peau et les glandes sous-maxillaires. Utilisez des écarteurs pour maintenir le muscle sterno-mastoïdien, exposer le champ opératoire et trouver l’artère carotide commune (ACC) gauche. Disséquez l’ACC sans tissu conjonctif et les nerfs environnants (sans endommager le nerf vague) et effectuez une ligature transitoire avant la bifurcation.
- Disséquez l’artère carotide externe (ECA) et faites un nœud permanent à la partie visible la plus distale. Placez une autre suture sous l’ECA, près de la bifurcation, et préparez un nœud lâche à utiliser plus tard.
- Disséquez l’artère carotide interne (ICA) et placez une pince microvasculaire dessus, à 5 mm au-dessus de la bifurcation. Assurez-vous de ne pas endommager le nerf vagal.
- Faites un petit trou dans l’ECA entre les ligatures serrées et lâches ; veillez à ne pas couper l’ECA en entier.
- Introduisez le filament et avancez-le vers le CCA. Serrez la ligature lâche dans l’ECA autour de la lumière pour fixer brièvement le filament dans cette position et éviter les saignements lors du retrait du clip microvasculaire.
- Retirez le clip microvasculaire et insérez le filament à travers l’ICA jusqu’à ce que l’origine de l’ACM soit atteinte en détectant une forte réduction (>80 %) du débit sanguin cérébral mesurée par le laser Doppler. Fixez le filament dans cette position en resserrant davantage le nœud autour de l’ECA.
note: Lorsque le filament va dans la bonne direction, il avance en douceur et aucune résistance ne doit être observée.
- Enregistrez les valeurs Doppler laser avant et après l’insertion du filament.
- Retirez l’écarteur et déplacez le muscle sterno-mastoïdien et les glandes sous-mandibulaires avant de suturer la plaie. Retirez la sonde laser Doppler et placez l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pendant 1 h (jusqu’au retrait du filament).