Génération d’un modèle de boucle du côlon proximal chez la souris : procédure chirurgicale permettant de générer une boucle du côlon proximal et de mesurer la perméabilité intestinale par détection de marqueurs fluorescents dans le sérum après injection intraluminale

Résumé

Source : Boerner, K. et al. Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle d’anse intestinale standardisé. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous décrivons une intervention chirurgicale visant à générer une boucle proximale du côlon de souris ou un segment pcLoop, suivie d’une injection intraluminale de marqueurs fluorescents dans le segment afin d’étudier la perméabilité épithéliale intestinale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Génération de l’anse proximale du côlon (pcLoop)

1. Préparation de la peau : Frottez la fourrure de la ligne médiane abdominale avec des tampons imbibés d’alcool ou une éponge de gaze imbibée d’éthanol à 70 %. Ne mouillez pas une large zone de fourrure avec de l’alcool pour éviter l’hypothermie.
2. À l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie médiane. Faites une incision verticale au milieu de l’abdomen (environ 2 cm de longueur) et exposez le péritoine. Veillez à ne pas blesser les organes intra-abdominaux.
3. Placez de la gaze de coton humide prédécoupée sur la cavité intra-abdominale exposée.
4. Utilisez des cotons-tiges humides pour mobiliser et extérioriser le cæcum. Placez délicatement le cæcum sur la gaze de coton humide.
   note: Le cæcum est localisé dans le quadrant caudal gauche de la cavité abdominale chez la majorité des souris, indépendamment du sexe de l’animal.
5. À l’aide de cotons-tiges humides, extériorisez tout l’iléon et placez-le sur une gaze de coton humide. Identifiez le côlon proximal et l’apport sanguin situé dans le mésocôlon. Mobiliser le côlon proximal et, à l’aide d’une pince à pointe fine, créer la première ligature dans une zone exempte de vaisseaux dans le mésocôlon à environ 0,5 cm distal du cæcum (Figure 1B).
6. Mesurez à 2 cm de la première ligature et créez une deuxième ligature à un endroit exempt d’apport sanguin dans le mésocôlon (figure 1C).
7. À l’aide de ciseaux fins, coupez soigneusement à côté de chaque ligature pour isoler un pcLoop.
   de 2 cm de long note: Avec des ciseaux fins soigneusement coupés à côté de chaque ligature pour isoler l’anse iléale de 4 cm, en gardant intacts l’apport sanguin et la membrane mésentérique, il est important de couper les deux extrémités pour isoler un pcLoop qui est doucement nettoyé du contenu luminal. Coupez soigneusement le tissu colique et le mésocôlon pour empêcher les petits vaisseaux de saigner dans la lumière intestinale. Si nécessaire, utilisez la cautérisation thermique pour limiter les saignements au site d’incision.
8. Rincez doucement le pcLoop avec du HBSS chaud pour éliminer les matières fécales à l’aide d’un tube d’alimentation jaune flexible fixé à une seringue de 10 ml (Préparez une seringue de 10 ml remplie de HBSS chaud et fixez-la à une sonde d’alimentation jaune. Cette seringue sera utilisée pour hydrater les tissus exposés pendant la chirurgie).
9. Lister les deux extrémités coupées du pcLoop rincé à l’aide d’une suture en soie.
10. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G, injectez lentement 200 μL de réactif tel que le FITC-dextrans (1 mg/mL dans le HBSS). Conservez la solution FITC-dextran non utilisée à l’abri de la lumière pour préparer la courbe standard après le prélèvement du sérum). Le pcLoop va se gonfler provoquant une distension modérée de la muqueuse (Figure 1D).
    note: Injectez le réactif dans la lumière pcLoop du côté opposé de l’artère mésentérique. Assurez-vous de la cohérence entre les animaux et créez un pcLoop de 2 cm de long pour assurer une distension égale de la muqueuse.
11. À l’aide de cotons-tiges humides, replacez doucement le pcLoop, l’iléon et le cæcum ligaturés dans la cavité abdominale.
12. Utilisez un porte-aiguille, une pince anatomique et des sutures en soie non résorbables 3.0 avec aiguille de coupe inversée pour fermer la paroi abdominale.
13. Placez l’animal dans une chambre d’anesthésie à température régulée pendant la période d’incubation.

Résultats

Figure 1 : Le modèle de l’anse du côlon proximal. (A) Vue d’ensemble schématique du modèle pcLoop. La laparotomie médiane est réalisée sur des souris sous anesthésie placées sur une planche de chirurgie à température contrôlée. (B) Extériorisation du cæcum (*), du côlon proximal, du mésocôlon et de l’iléon. Deux sites adéquats pour la ligature sont identifiés ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Équipement et matériel
Tampons d’alcool BD	Bd	326895
BD 1ml Seringue à tuberculine sans aiguille	Bd	309659
Aiguille BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"	Bd	305122
Aiguille BD PrecisionGlide, 30 g x 1/2 po	Bd	305106
Applicateur d’embout en coton (coton-tige), 6", stérile	FisherScientific	25806 2WC
Éponges de gaze remplies de coton Dynarex, non stériles, 2 » x 2 »	Medex	Référence 3249-1
Vaporisateur d’anesthésie EZ-7000 (système classique, y compris les unités de chauffage)	Systèmes E-Z	EZ-7000
Kimwipes, petit (lingette en tissu)	FisherScientific	Référence 06-666
Ciseaux Moria Fine	Le	Référence 14370-22
Puralube Vet Ogument, lubrifiant oculaire stérile	Dechra	12920060
Pince à anneau (pince à tissu contondant)	Le	Référence 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Soie Tressée Noire, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Pince Semken (anatomique forceps)	Le	Référence 1108-13
Sofsilk non résorbable enduit suture noire tressée soie taille 3-0, 18", aiguille 19mm longueur 3/8 cercle coupe inversée	HenrySchein	SS694
Pince fine d’étudiant, coudée	Le	Référence 91110-10
Seringue 10ml PP/PE sans aiguille	Millipore Sigma	Z248029
Réactifs
L’isoflurane	halocarbure	Référence 12164-002-25
Fluorescéine Isothiocyanate-Dextran, poids moléculaire moyen 4.000	sigma	Référence 60842-46-8