Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. EDL isolement musculaire et digestion de la collagénase
- Vaporisez tout l’équipement avec de l’éthanol à 70 % pour éviter toute contamination.
- Sacrifiez la souris conformément à la réglementation nationale en matière d’expérimentation animale.
- Vaporisez les membres postérieurs de la souris avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux fins et incurvés durcis (tranchant de 24 mm) et des pinces fines (Dumont 7, courbes ou droites) pour enlever la peau et exposer les muscles sous-jacents. Eviter tout contact des muscles sous-jacents avec la fourrure (augmente le risque de contamination).
- Retirez le fascia environnant à l’aide d’une pince fine et incurvée sans endommager les muscles sous-jacents (Figure 1A). Fermez la pince pour éviter de vous pencher.
- Utilisez des pinces incurvées pour exposer les tendons distaux du muscle TA (tibial antérieur) et EDL. Pour retirer le TA, saisissez le tendon distal TA à l’aide d’une pince et coupez-le avec des ciseaux à ressort Vannas fins (tranchant de 5 mm, pointe de 0,35 mm de diamètre). Tout en tenant le TA au niveau du tendon, tirez-le vers le genou et coupez le muscle près du genou (Figure 1B), le muscle EDL est maintenant exposé.
note: Assurez-vous que seul le tendon TA est saisi dans cette étape, sinon l’EDL sous-jacent pourrait être endommagé. Lorsque vous coupez le muscle TA, assurez-vous que les tendons du genou sont facilement visibles par la suite.
- Soulevez le tendon EDL distal à l’aide d’une pince fine incurvée et coupez-le à l’aide de ciseaux à ressort Vannas fins (figure 1C). Exposez le tendon proximal de l’EDL en tirant soigneusement l’EDL vers le genou. Coupez le tendon proximal avec de fines ciseaux à ressort Vannas. Transférez le muscle EDL dans la solution de digestion de la collagénase préchauffée à 37 °C (2,5 ml), dans le tube de réaction de 15 ml. La solution de collagénase est préparée selon cette procédure :
- Préparez la solution de digestion de la collagénase en dissolvant la collagénase de type 1 à 0,2 % (p/v) (de Clostridium histolyticum) dans du DMEM (milieu d'Eagle modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium), filtrez à travers un filtre de 0,22 μm. (Figure 1D).
note: Faites une petite incision au niveau du tissu conjonctif externe du genou pour exposer complètement le tendon EDL proximal. Assurez-vous de n’attraper que les tendons et de ne pas trop étirer l’EDL.
- Répétez les étapes 1.3 à 1.6 avec la deuxième liste EDL. Ajoutez les deux muscles EDL dans le même tube de réaction de 15 ml rempli de solution de digestion de collagénase de 2,5 ml.
- Incuber les muscles EDL dans le tube réactionnel à 37°C dans un bain d’eau circulante.
note: Le temps d’incubation dépend de plusieurs facteurs, tels que l’activité de la collagénase, l’âge de la souris et la quantité de tissu fibreux. Le temps d’incubation typique des muscles EDL des souris adultes (âgées de 2 à 6 mois) est de 1 à 1,5 h et celui des souris âgées (âgées de 18 mois) de 1,5 à 2 h.
- Pour éviter une digestion excessive des muscles, vérifiez les muscles pendant le temps de digestion. Arrêtez la digestion lorsque les muscles se relâchent et que des myofibres uniques sont visibles (Figure 1E). Transférez soigneusement les muscles avec la pipette de gros calibre vers le premier puits de la plaque préchauffée à 12 puits contenant le milieu d’isolement des myofibres (figure 1G), qui est préparé comme suit :
- Compléter le DMEM (milieu d'Eagle modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium) avec 20 % de FBS (sérum fœtal bovin), filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Ajouter le milieu aux plaques d’isolement pré-enduites (plaque de 12 puits, 2 à 4 mL de milieu d’isolement par puits) environ 30 min avant l’isolement et équilibrer dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
2. Dissociation des myofibres
- Pour les étapes suivantes, utilisez un microscope binoculaire stéréo, de préférence équipé d’une plaque chauffante (37 °C). Utilisez la pipette de grand calibre pour rincer les muscles avec un produit d’isolation chaud jusqu’à ce que les myofibres soient libérées. Dissociez les muscles avec la pipette de grand calibre jusqu’à ce que le nombre souhaité de myofibres flotte librement dans la solution.
note: Évitez une trituration excessive pour réduire le risque d’endommager les myofibres. L’utilisation d’une plaque chauffante pour la dissociation des myofibres est fortement conseillée car la température baisse pendant le processus d’isolement, ce qui entraînera la mort des myofibres.
