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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Aiguilles en verre stériles
- Allumez l’extracteur de pipette à aiguille.
- Ajustez le bouton de chauffage jusqu’à ce que l’écran affiche 12.6.
- Ouvrez la porte et faites passer manuellement le tube capillaire de 5 μL à travers la pince supérieure et le filament chauffant jusqu’à ce que la moitié du tube dépasse sous le filament (Figure 1A).
- Vérifiez que le tube capillaire se trouve dans la rainure en « V » de la pince supérieure. Serrez la pince supérieure.
- Avec la pince inférieure ouverte, ajustez manuellement la glissière verticale jusqu’à ce que la pince inférieure atteigne sa limite supérieure. Vérifiez que le tube se trouve dans la rainure en « V » de la pince inférieure. Serrez la pince inférieure.
- Fermez la porte et vérifiez que le voyant « Prêt » est allumé. Appuyez sur le bouton Start pour lancer la séquence de chauffage et de traction (Figure 1B).
- Assurez-vous que l’appareil de chauffage s’éteint automatiquement une fois que la chaleur et la gravité ont séparé le tube capillaire (Figure 1C) et que la glissière se déplace vers le bas.
- Ouvre la porte. Tout en tenant le haut du tube capillaire, desserrez la pince supérieure. Retirez le tube capillaire supérieur et mettez-le de côté.
- Tenez le tube capillaire dans la glissière inférieure et desserrez la pince inférieure. Retirez le tube capillaire inférieur et mettez-le de côté.
- Utilisez un chanfreineur à microélectrodes avec une plaque abrasive en alumine de 0,05 μm pour biseauter le tube capillaire tiré afin de créer les aiguilles d’injection.
- Versez suffisamment d’eau sur la plaque de broyage pour couvrir la surface (Figure 1D).
- Allumez le chanfrein pour qu’il commence à tourner à 60 tr/min. Placez le tube capillaire tiré dans le collier de serrage de la pipette dans la rainure en « V ». Serrez la pince et ajustez l’angle de la pince à pipette à 30°.
- Ajustez l’extrémité du bord pointu du tube capillaire à environ deux tiers du centre de rotation de la plaque de broyage.
- Abaissez le tube capillaire serré en ajustant le bouton de commande grossier situé en haut du manipulateur. Continuez à abaisser le tube capillaire jusqu’à ce que l’extrémité du tube capillaire dépasse sous la surface de l’eau et entre en contact avec la surface abrasive de la plaque de broyage.
- Surveillez la progression du biseautage à l’aide du microscope fixé à la chanfreineuse. Après 5 min, ajustez la commande fine pour soulever l’aiguille de verre de la plaque de broyage.
- Retirez l’aiguille de verre et placez-la sous un grossissement de 10x pour vérifier l’extrémité du tube capillaire (Figure 1E,F).
- Pour vous assurer qu’il n’y a pas d’obstruction, insérez l’aiguille en verre dans un porte-pipette sur une seringue et poussez de l’air dans un tube de 1 ml d’éthanol à 99 %. Si des bulles d’air se forment à la pointe de l’aiguille, celle-ci n’est pas bloquée et peut être utilisée pour la microinjection. Ce procédé garantit également la stérilité des aiguilles de verre.
- Un tube capillaire peut contenir jusqu’à 5 μL de liquide. Marquez le tube capillaire en 10 sections pour calculer les distances sur l’aiguille à marquer pour des volumes de 0,5 μL. Marquez une balance avec une distance de 0,5 μL pour une préparation future. Pour une aiguille de 5 μL, des distances de 0,7 mm équivalent à 0,5 μL (Figure 1G).
2. Injection intravitréenne chez la souris
- Effectuer toutes les procédures de cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
- Préparez le site de l’intervention en plaçant des sous-vêtements médicaux sur la table d’opération.
- Allumez le micro-injecteur et ouvrez la vanne de gaz sur le réservoir d’air comprimé fixé au micro-injecteur. Ajustez le régulateur de réservoir jusqu’à ce que le débit de gaz soit d’environ 60 psi.
- Sur le micro-injecteur, appuyez sur Mode jusqu’à ce que l’écran affiche Balance. Appuyez sur Balance et placez la souris de l’ordinateur sur la table d’opération. Connectez le porte-pipette en acier inoxydable au tube fixé à « Fill/Output » de l’injecteur. Ce tube est toujours relié à l’injecteur.
- Insérez l’aiguille capillaire à l’autre extrémité du porte-pipette en vissant fermement le connecteur du porte-pipette autour de l’aiguille.
- Allumez le microscope ophtalmique et allumez sa lumière à une intensité de 50 %. Ajustez le microscope sur le site de l’intervention sur la table d’opération et ajustez le microscope à la mise au point souhaitée.
- Avant le début de la procédure, confirmez que la souris est correctement anesthésiée en testant le réflexe de retrait de la pédale. Assurez-vous de suivre votre protocole d’anesthésie approuvé par l’IACUC.
- Placez la souris anesthésiée sur les sous-tapis médicaux, le nez pointé vers la droite et penché sur le côté gauche.
- Regardez l’œil droit de la souris à l’aide d’un microscope ophtalmique et ouvrez les paupières en ouvrant les pinces d’une pince à action inverse de chaque côté de l’œil pour exposer le site d’injection (figure 2C).
- Remplissez l’aiguille capillaire avec la solution bactérienne de Bacillus cereus (ATCC 14579) (dilution de 200 UFC/μL) en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur le tapis de souris connecté au micro-injecteur (Figure 2D).
- Fixez la tête de l’animal avec la main gauche et placez la pointe de l’aiguille sur le limbe de l’œil. Avec l’aiguille en position biseautée vers le haut et à un angle de 45°, percez l’œil de la souris, mais assurez-vous que seule la pointe pointue de l’aiguille (~0,5 mm) est insérée lors de l’injection.
- Une fois la pointe de l’aiguille insérée, déplacez la main gauche de la tête de souris vers le tapis de souris et faites un clic droit sur le tapis de souris pour injecter 0,5 μL de dilution de B. cereus préparée dans un bouillon de perfusion de cerveau et de cœur (BHI). Pour éviter les fuites, laissez la pointe de l’aiguille à l’intérieur de l’œil de la souris pendant 2 à 3 secondes avant de la retirer (Figure 2E).
- Relâchez la pince et placez la souris dans une cage posée sur un coussin chauffant. Surveillez ces souris jusqu’à ce qu’elles se soient remises de l’anesthésie (Figure 2F).
- Une fois que les souris sont récupérées de l’anesthésie, remettez la cage dans son support approprié. Si les souris doivent être soumises à une analyse de la fonction rétinienne par électrorétinographie, les cages doivent être renvoyées dans une pièce sombre pour une bonne adaptation à l’obscurité.
