Dosage de la quantification d’une infection bactérienne : méthode de quantification de la charge bactérienne intraoculaire dans un modèle murin d’endophtalmie bactérienne

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation du tube de récolte

1. Placez des billes de verre stériles de 1 mm dans des tubes à bouchon à vis de 1,5 ml.
2. Stérilisez ces tubes dans un autoclave à sec. Laissez refroidir les tubes à température ambiante avant utilisation.
3. Ajouter 10 ml de 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml.
4. Ajoutez 1 comprimé de comprimé cocktail d’inhibiteur de protéase dans le tube. Mélanger par vortex.
5. Pipeter 400 μL de 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant un inhibiteur de protéase dans chaque tube de récolte autoclave. Étiquetez les tubes et placez-les sur de la glace. (Figure 1A).

2. Récolte des yeux

1. Effectuer toutes les procédures de cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
2. Euthanasier la souris par inhalation de CO₂. Utilisez une méthode secondaire pour confirmer l’euthanasie.
3. Tenez la tête de la souris euthanasiée en place et ouvrez la pince à pointe fine de chaque côté de l’œil infecté. Appuyez vers la tête pour étaler l’œil. Une fois que les pinces sont derrière le globe de l’œil, pressez-les ensemble. Tirez la pince pour l’éloigner de la tête pour détacher le globe oculaire (Figure 1B).
4. Placez immédiatement le globe oculaire dans un tube de récolte étiqueté. Placez les tubes sur de la glace pendant 60 minutes au maximum (Figure 1C).

3. Numération bactérienne intraoculaire

1. Effectuer toutes les procédures de cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
2. Confirmer que tous les tubes de prélèvement sont bien fermés et qu’ils sont équilibrés lorsqu’ils sont dans l’homogénéisateur de tissus (figure 2A). Allumez l’homogénéisateur de tissus pendant 1 min pour homogénéiser les échantillons. Attendez 30 s, puis allumez pendant une minute supplémentaire. Placez les tubes sur de la glace (figures 2B et C).
3. Diluez chaque échantillon 10 fois en série en transférant séquentiellement 20 μL d’homogénat dans 180 μL de PBS stérile. Diluer jusqu’à ce qu’un facteur de ^10-7 soit atteint (Figure 2D).
4. Étiquetez chaque rangée d’une plaque BHI carrée et chaude avec les facteurs de dilution appropriés. Transférez 10 μL de chaque dilution d’affilée sur la plaque BHI supérieure inclinée d’environ 45°. Laissez couler l’échantillon jusqu’à ce qu’il atteigne presque le fond de la plaque, puis posez la plaque à plat (Figure 2E).
5. Lorsque l’échantillon est absorbé dans la gélose BHI, transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C. Les colonies doivent commencer à être visibles 8 h après avoir été placées dans l’incubateur.
6. Retirer la plaque de l’incubateur avant que la croissance des colonies de B. cereus n’interfère avec l’identification des colonies individuelles (figure 2F).
7. Pour une représentation précise de la concentration dans l’échantillon, comptez la rangée qui compte entre 10 et 100 colonies. Par exemple, une rangée avec une fraction de dilution de ^10-4 qui comporte 45 colonies aura une concentration de 4,5 x 10⁵ UFC/mL.
8. Pour calculer le nombre total de bactéries par œil, il faut multiplier la concentration par 0,4, ce qui représente le volume en millilitres de 1x PBS utilisé pour homogénéiser l’œil. Par exemple, la concentration de 4,5 x 10⁵ UFC/mL se traduirait par 1,8 x 10⁵ UFC B. cereus par œil.

Figure 1 : Prélèvement d’un œil de souris infecté. Après l’infection, après le moment souhaité, prélever les yeux de souris infectés à l’aide d’une pince à épiler stérile. (A) PBS contenant des billes de verre stériles. (B) Prélèvement de l’œil infecté. (C) Tube de récolte contenant un œil de souris.

Figure 2 : Traitement de l’œil prélevé pour la numération bactérienne intraoculaire. (A) Tube de récolte avec l’œil infecté fermement fixé à un homogénéisateur de tissus. (B) Les yeux infectés ont été homogénéisés deux fois pendant 1 minute chacun. Dilution de suivi (D) des homogénats oculaires (C) et placage ultérieur (E) pour la quantification bactérienne. (E) Colonie individuelle représentative de Bacillus cereus après dilution de la trace.