Perfusion pulmonaire ex vivo : une technique de recherche pulmonaire dans un modèle de lapin

Résumé

Source : Pacheco-Baltazar, A., et al., Système de perfusion pulmonaire isolé dans le modèle de lapin. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre une technique ex vivo de perfusion pulmonaire isolée. Il s’agit d’un outil de recherche pulmonaire qui aidera à l’étude de divers mécanismes physiologiques et pathologiques impliqués dans les procédures de transplantation pulmonaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Commutation :

1. Placez les poumons et le cœur du lapin fraîchement isolés sur une gaze stérile sur une boîte de Pétri.
2. Pour prévenir l’atélectasie, ventilez les poumons à l’aide d’une ventilation à pression positive avec une pression expiratoire positive (PEP) réglée à 2 cmH₂O.
3. Retirez les ventricules en les coupant du cœur au niveau du sillon auriculo-ventriculaire.
4. Après avoir ouvert les deux ventricules, introduisez la canule de l’artère pulmonaire de 4,6 mm de diamètre extérieur pour le lapin avec un panier dans l’artère pulmonaire et introduisez la canule de l’oreillette gauche de 5,9 mm de diamètre extérieur pour le lapin avec le panier à travers la valve mitrale dans l’oreillette gauche.
5. Utilisez une suture en soie 4-0 dans l’artère pulmonaire et l’oreillette gauche pour fixer les canules. Incluez les tissus environnants dans les ligatures de l’artère pulmonaire et de l’oreillette gauche pour éviter la distension de ces structures.
6. Injectez 250 ml de solution isotonique saline à travers les canules artérielles pour évacuer le sang restant du lit vasculaire.

2. Technique de perfusion :

1. coup monté:
   1. Placez soigneusement les poumons isolés dans la chambre pulmonaire.
   2. Fixez la trachée au transducteur sur le couvercle de la chambre.
   3. Connectez les vaisseaux canulés au système de perfusion.
   4. Fermez la chambre et sécurisez-la à l’aide du verrou rotatif.
      note: Le circuit de perfusion à recirculation se compose d’un réservoir veineux ouvert, d’une pompe péristaltique, d’un échangeur de chaleur et d’un piège à bulles.
   5. À ce stade, fixez le couvercle de la chambre et basculez un robinet d’arrêt pour passer de la ventilation à pression positive à la ventilation à pression négative. Pour vérifier la ventilation à pression négative des poumons et la fermeture étanche à l’air de la chambre, inspectez l’excursion respiratoire du poumon et la pression de la chambre sur le manomètre.
   6. Perfuser les poumons avec 200 mL de perfusat artificiel non sanguin (un tampon bicarbonate de Krebs-Ringer contenant 2,5 % d’albumine bovine).
   7. Commencer le débit de perfusat à 3 mL/min/kg, puis augmenter lentement le débit sur une période de 5 minutes jusqu’à 5 mL/min/kg. Atteindre un débit de 8 mL/min/kg au cours des 5 minutes suivantes, puis après une autre période de 5 minutes, atteindre un débit maximal de 10 mL/min/kg. Veillez à éviter que l’air ne pénètre dans le circuit.
      note: Maintenir le pH et la température du perfusate dans les plages physiologiques (pH 7,4-7,5 ; température, 37 °C-38 °C). Pour ajuster le pH, ajoutez du NaHCO₃ (1N) ou augmentez le débit de dioxyde de carbone. Vous pouvez également utiliser du HCl (0,1 N) pour acidifier.
2. Paramètres:
   1. Vérifiez si les paramètres de perfusion et de ventilation prédéterminés sont réglés selon les besoins.
   2. Aérer les poumons avec de l’air humidifié à une fréquence de 30 bpm, un volume courant de 10 mL/kg et une pression expiratoire (Pe) de 2 cmH₂O.
      note: La pression artérielle pulmonaire (0-20 mmHg) correspond à la hauteur du niveau de liquide dans l’oxygénateur ou le réservoir en centimètres au-dessus du tronc pulmonaire, tandis que la pression veineuse pulmonaire correspond à la hauteur de la chambre d’équilibrage de pression au-dessus de l’oreillette gauche. Les deux valeurs peuvent être modifiées. Notez que la pression de l’oreillette gauche est également de 0 à 20 mmHg.
3. Réalisation des conditions de la zone 3 :
   1. Utilisez les deux cathéters connectés aux orifices latéraux des canules fixés dans l’artère pulmonaire, l’oreillette gauche et les transducteurs de pression pour mesurer les pressions artérielles (Pa) et veineuse (Pv).
   2. Réglez les pressions de base au niveau du hile pulmonaire (référence zéro).
   3. Réaliser les expériences dans des conditions de ventilation de zone 3. Pour y parvenir, attendez 10-15 min pour obtenir un équilibre caractérisé par un état isogravimétrique.
   4. Assurez-vous que la pression veineuse est supérieure à la pression alvéolaire (Palv) et que la pression artérielle reste supérieure aux deux (Pa > Pv > Palv) pour que les conditions de la zone 3 se produisent.
   5. S'assurer que le poids des poumons reste constant et que les pressions artérielles et auriculaires gauche sont stables pour atteindre les conditions de la zone 3 afin d'ouvrir un maximum de vaisseaux pulmonaires et de maintenir le contenu du lit microvasculaire pendant l'expérience.
      note: La mesure de Kfc en tant qu’indicateur d’œdème pulmonaire n’a pas de variation entre un système de perfusion manuel et un système de perfusion automatique.
4. Contrôle électronique et traitement du signal : S’assurer que le débit respiratoire, les changements de poids, la pression microvasculaire, le volume courant, la résistance vasculaire, entre autres, sont enregistrés sur une unité électronique centrale multiple qui intègre les signaux provenant des transducteurs et les affiche sur le système d’évaluation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube Tygon E-Lab à 2 arrêts, 3,17 mm ID, 12/paquet, noir/blanc	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	N° 73-1864
Adaptateur pour ventilation à pression positive sur IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4312
Adaptateur pour ventilation à pression positive sur IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4312
Alimentation alternative en gaz sans pression pour IPL-4 : Pour alimenter la trachée avec un mélange de gaz différent de l’air ambiant lors d’une ventilation négative	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4309
Unité de base pour le lapin au fœtus porc isolé Poumon perfusé	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4138
Sérum bovin A2 :D41albumine lyophilisée en poudre	sigma	Référence 3912	500 grammes
Chlorure de calcium, CaCl2·2H2O.	JT Baker	Référence 10035-04-8
Flacons cryogéniques	Corning	430659	2 mL
D-glucose, C6H12O6.	sigma	Référence G5767
Sonde différentielle basse pression DLP2.5, portée +- 2,5 cmH2O, connecteur HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-3882
Transducteur de pression différentielle MPX, portée +- 100 cmH2O, connecteur HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-0064
Tubes Eppendorf
Éthanol de qualité HPLC absolue	Caledon
Tubes Falcon			14 ml
Pompe péristaltique Harvard P-230 (complète avec boîtier de commande et entraînement du moteur P-230)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70 à 7001
Pneumotachymètre linéaire chauffé Plage de débit de 0 à 10 L/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 59-9349
Régulateur de chauffage pour pneumotachymètre simple 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 59-9703
héparine	Pise		Interface utilisateur 5000
Colonne HPLC (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4,6 mm
Filtre à seringue hydrophile	Millex	SLLGR04NL	4 millimètre
Système de base IPL-4 pour poumon isolé de lapin à fœtus de porc, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4296
Système central IPL-4 pour poumon isolé de lapin à poumon de porc fœtal, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4296
Réservoir en verre chemisé pour solution tampon, avec fritte et tube, 6,0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-0322
Thermostatique Lauda, type E-103, 230 V/50 Hz, volume de bain 3 L, plage de température 20 à 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-0125
Canule de l’oreillette gauche pour lapin avec panier, OD 5,9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4162
Transducteur de pression artérielle basse gamme P75 pour module PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-0020
Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4·7H2O	JT Baker	Référence 10034-99-8
Tube de microcentrifugation	Corning	430909
Option de contrôle de la ventilation à pression négative avec régulateur de pression pour IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4298
Lapins de Nouvelle-Zélande
PISABENTAL (Pentobarbital sodique)	Pise	Réf. : 7833-215
Valise PLUGSYS, type 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-0045
Module de compteur de temps PLUGSYS TCM	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	N° 73-1750
transducteur PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-0065
transducteur PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	N° 73-1793
PLUGSYS VCM-4R Module de contrôle de la ventilation avec régulateur de pression	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Chlorure de potassium, KCl.	JT Baker	Référence 3040-01
Dihydrogénophosphate de potassium, KH2PO4	JT Baker	Référence 7778-77-0
Canule artérielle pulmonaire pour lapin avec panier, OD 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4161
Servocontrôleur pour la perfusion (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-2806
Tube de microcentrifugation à capuchon pression	Costar	Référence 3620	1,7 mL
Bicarbonate de sodium, NaHCO3	sigma	S6014
Chlorure de sodium, NaCl.	sigma	Réf. S9888
Gants chirurgicaux n° 7 1/2
Gants chirurgicaux n° 8
Tubes Taygon	Masterflex
Canule trachéale pour lapin, OD 5,0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Référence 73-4163

Module amplificateur de Module amplificateur de