Préparation d’un modèle de lapin conscient pour une vidéo-EEG-ECG-oxymétrie-capnographie simultanée pour des interventions expérimentales : une procédure d’implantation d’électrodes EEE-ECG et de fixation de sondes respiratoires dans un modèle de lapin

Résumé

Source : Bosinski, C. et al., Surveillance multi-systèmes pour l’identification des convulsions, des arythmies et de l’apnée chez les lapins conscients retenus. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre la procédure d’implantation d’électrodes EEG-ECG et de fixation de sondes respiratoires dans un modèle de lapin pour l’acquisition et l’analyse des enregistrements de ses signaux biologiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Implantation d’électrodes EEG-ECG et fixation de moniteurs respiratoires

1. Retirez un lapin du transporteur et placez-le sur les genoux d’un enquêteur assis.
2. Tenez le lapin verticalement et gardez-le près du corps de l'enquêteur.
3. Abaissez le lapin en position couchée, avec la tête du lapin sur les genoux de l'enquêteur et la tête du lapin plus basse que le reste de son corps.
   note: Cette manœuvre détend l’animal et minimise la probabilité qu’il tente de se déplacer ou de s’échapper tout en plaçant les électrodes.
4. Maintenant que le lapin est attaché en position couchée, demandez à un deuxième enquêteur d’étaler la fourrure jusqu’à ce que la peau puisse être identifiée et isolée du tissu sous-jacent.
5. Insérez des électrodes pliées à 35° par voie sous-cutanée dans chaque aisselle (Figure 1A).
   note: Les électrodes doivent être poussées de manière à ce qu’elles soient solidement accrochées à la peau, mais ne pénètrent pas dans les structures plus profondes. Le fait que l’électrode entre et sorte de la peau (de part en part) réduit le risque que les sondes se délogent lorsque le lapin est placé dans la contention ou s’il bouge pendant l’expérience (figure 1B). Toutes les électrodes sont stérilisées avec de l’éthanol à 70 % avant d’être placées.
6. Placez des fils sur la poitrine en arrière des membres antérieurs droit et gauche et sur l’abdomen en avant du membre postérieur gauche. Placez une picot-électrode de terre à l’avant du membre postérieur droit sur l’abdomen (Figure 2A).
7. Une fois que toutes les sondes ECG sont correctement placées, remettez le lapin en position couchée, avec les sondes remontant d’un côté de l’abdomen du lapin, et transférez le lapin dans une contention de taille appropriée (par exemple, 6 » x 18 » x 6 »). Lorsque vous placez le lapin dans la contention, tirez le fil lâche vers le haut pour empêcher le lapin de retirer les électrodes avec ses pattes. Collez les fils sur le côté de la contention afin qu’ils ne se coincent pas sous le lapin pendant l’expérience (figure 2B).
8. Fixez le lapin dans la contention en abaissant la contention autour du cou et en le verrouillant en place. De plus, déplacez les membres postérieurs sous l’animal et fixez la retenue arrière.
   note: Il faut pouvoir insérer 1 à 2 doigts dans l’espace sous le cou pour s’assurer qu’il n’est pas trop serré. En particulier lors d’expériences où il peut y avoir un mouvement moteur, il est important de resserrer la ceinture de retenue pour minimiser les mouvements, les blessures potentielles à la colonne vertébrale, la luxation d’un membre et la capacité de donner un coup de pied à l’arrière (figure 2B). Les lapins ont été maintenus dans la contention pendant ~5 h sans aucun problème lié à une augmentation des mouvements ou à des signes de déshydratation.
   1. Pour les petits lapins (p. ex. moins de 2 mois), placez un coussin d’appoint en caoutchouc sous l’animal pour le soulever, ce qui empêche le lapin de reposer son cou sur le bas de l’appuie-tête (figure 2C).
      note: Une chute soudaine de la fréquence respiratoire et cardiaque peut être secondaire à un conflit cervical. Si cela se produit, desserrez la retenue du cou et soulevez la tête du lapin pour soulager toute compression du cou.
   2. Lorsque la retenue arrière ne suit pas étroitement le dos/la colonne vertébrale du lapin, placez une entretoise en PVC pour éviter tout mouvement qui pourrait causer des blessures à la colonne vertébrale.
      note: Par exemple, un tuyau en PVC de ~14 cm de long x 4 po de diamètre intérieur, avec les 25 à 33 % inférieurs retirés, peut être placé sur le lapin avec de la mousse pour fournir une retenue appropriée (figure 2C).
9. Maintenant que le lapin est bien placé dans la contention, insérez les électrodes droites sous-cutanées de 7 à 13 mm dans le cuir chevelu (Figure 1A). En utilisant un angle d’approche de 45°, faites passer les fils entre les oreilles et attachez lâchement les fils au dispositif de retenue derrière la tête pour maintenir le placement de la sonde. Placez 5 dérivations EEG dans les positions suivantes : antérieure droite, antérieure gauche, occipitale droite, occipitale gauche et une sonde de référence centrale (Cz) au point situé entre les 4 autres dérivations (Figure 2D).
   note: Les électrodes sont correctement placées lorsqu’elles sont positionnées dans le tissu sous-cutané contre le crâne. Ce placement minimise les artefacts du nez, des oreilles et d’autres muscles environnants. Certains artefacts du mouvement rythmique du nez sont inévitables. Les dérivations EEG antérieures doivent être placées au milieu des yeux du lapin et pointées vers l'avant. Les dérivations occipitales doivent être placées en avant des oreilles et pointeront dans la direction médiale. Cz est placé au centre du haut de la tête à un point qui se trouve entre les 4 électrodes (à mi-chemin entre Lambda et Bregma, le long de la ligne de suture). La broche de l’électrode Cz pointe vers l’avant.
   1. Passez les fils EEG entre les oreilles, pour éviter que le lapin n’essaie de mordre les fils.
10. Fixez le pléthysmographe de l'oxymètre de pouls à l'oreille du lapin sur la veine marginale de l'oreille.
    note: Il peut être nécessaire de raser l’excès de poils de l’oreille pour améliorer le signal ou d’utiliser de la gaze pour maintenir le capteur en place.
    1. Assurez-vous que la fréquence cardiaque sur la pléthysmographie est corrélée à la fréquence cardiaque de l’ECG et que la saturation en oxygène est affichée (Figure 3C).
11. Placez délicatement le masque facial avec tube de capnographie sur la bouche et le nez du lapin (Figure 2H). Fixez le masque facial avec de la ficelle enroulée autour du masque et attachez les deux extrémités de la ficelle à la contention. Fixez l’autre extrémité de la gaine de capnographie au moniteur de signes vitaux.
    note: Il est important d'éviter que la ficelle ne repose sur les yeux du lapin pendant l'expérience. Pour ce faire, collez la ficelle au milieu de la contention entre les oreilles du lapin. Afin d’améliorer le signal de capnographie, créez une valve unidirectionnelle à l’aide de ruban adhésif et d’un mince morceau de nitrile qui permettra à l’oxygène de pénétrer dans la pièce en T et dirigera le CO2 expiré dans le tube de capnographie (Figure 2I).

2. Enregistrement de la vidéo-EEG-ECG

1. Effectuez un enregistrement vidéo-EEG-ECG à l’aide d’un logiciel EEG disponible dans le commerce.
   note: Les sondes biopotentielles et la vidéo sont verrouillées dans le temps pour corréler ultérieurement les signaux électriques et vidéo (par exemple, un pic EEG avec une secousse myoclonique).
2. Confirmez une connectivité optimale, sans dérive de base, sans bruit électrique de 60 Hz et avec un rapport signal/bruit élevé. Plus précisément, assurez-vous que chaque phase de la forme d’onde cardiaque peut être visualisée sur l’ECG et que les ondes delta, thêta et alpha ne sont pas visuellement obscurcies par le bruit à haute fréquence sur l’EEG.
   1. Si toutes les électrodes produisent des quantités excessives de bruit, ajustez le fil de référence central. Si une seule électrode est excessivement bruyante, enfoncez-la plus profondément dans la peau ou repositionnez-la jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de métal exposé.
3. Ajustez la vidéo de manière à ce que tous les lapins puissent être vus simultanément, ce qui permet de corréler l’activité motrice avec les résultats de l’EEG (Figure 3A).
   note: Le système prend en charge les enregistrements simultanés d’EEG/ECG/oxymétrie/capnographie d’un maximum de 7 lapins.
4. Démarrez l’enregistrement de base de chaque animal pendant au moins 10 à 20 minutes ou jusqu’à ce que la fréquence cardiaque se stabilise à un état calme et détendu (200-250 bpm) et que les lapins ne présentent pas de grands mouvements pendant au moins 5 min. Acquérez des données électroniques sur toute la bande passante sans aucun filtre. Afin de mieux visualiser les données, réglez le filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) à 1 Hz et le filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) à 59 Hz.
   note: Un autre signe que le lapin est détendu est l’apparition de fuseaux de sommeil EEG (discutés plus loin).
5. Ajoutez des notes verrouillées pendant l’expérience en temps réel pour indiquer le moment des interventions (p. ex., administration de médicaments) et des événements neurocardiaques (p. ex., pic d’EEG, crises motrices, battements ectopiques et arythmies) et des artefacts moteurs/investigateurs.
   note: En raison de la fréquence à laquelle l’investigateur doit appliquer une intervention (par exemple, stimulation photique, administration de médicament), pour minimiser le stress d’un investigateur entrant et sortant de la pièce et ouvrant/fermant la porte, l’investigateur reste de l’autre côté de la pièce tout au long de l’expérience. L’enquêteur s’assoit aussi loin que possible de l’animal et reste immobile et silencieux pour minimiser le risque de déranger les animaux.

Résultats

Figure 1 : Image des électrodes EEG et ECG. (A) Électrodes ECG courbées et électrodes EEG droites. (B) Comment accrocher l’électrode ECG dans le tissu sous-cutané du lapin, de manière à ce qu’elle soit de part en part. Abréviations (LL : Membre gauche, RA : Bras droit, RL : Membre droit, LA : Bras gauche, RF : Front droit, LF : Front gauche, Cz : Centre, RO : ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ordinateur	vallon	Ordinateur Optiplex 5040	Ordinateur d’acquisition
Électrode ECG	Lien Rythmique	RLSND116-2,5	Électrodes sous-cutanées de 13 mm pliées à 35 degrés (0,4 mm de diamètre)
Électrode EEG	Lien Rythmique	RLSP513	Électrodes sous-cutanées droites à 5 torsions de 13 mm (0,4 mm de diamètre)
EEGLAB (2020)	Centre Swartz pour les neurosciences computationnelles	Libre accès	Peut effectuer une analyse spectrale de l’EEG
Adaptateur Ethernet vers Ethernet	Linksys	USB3G16	Adaptateur pour connecter l’appareil photo à l’ordinateur
Mousse	générique	n/a	Réduit la pression appliquée sur le cou des petits lapins par la contention afin de prévenir les effets cardiorespiratoires néfastes de la compression du cou
MATLAB (R2019b, mise à jour 5)	MathWorks	n/a	Requis pour exécuter EEGLAB
microphone	Stéréo Sony	ECM-D570P	Enregistrement des manifestations audibles des crises
Ruban médical Micropore, papier, blanc	3m	N° 1530-1	Utilisé pour sécuriser les fils et créer une attelle d’oreille
Natus NeuroWorks	Natus	Référence LC101-8	Logiciel d’acquisition et d’examen
Stimulateur photique	herbe	PS22	Stimulateur pour contrôler la fréquence, le retard, la durée, l’intensité des impulsions lumineuses
Organisateur / empaqueteur de fils en plastique	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Regroupez les fils pour réduire le bruit
PS 22 Stimulateur photique	Instruments d’herbe	BZA641035	Lumière stroboscopique avec fréquence, retard et intensité du flash réglables
Tuyau en PVC	générique	n/a	Empêche les petits lapins de donner des coups de pied dans leurs pattes arrière et de causer des blessures à la colonne vertébrale
Contention pour lapin	Plas-Labs	501-TC	Des contentions pour lapins de différentes tailles sont disponibles. 6 » x 18 » x 6 » dans cette étude.
Coussinet en caoutchouc (booster)	générique	n/a	Élève les petits lapins dans la contention pour éviter la compression du cou
Clip d’oreille SpO2	NONIN	Référence 61000	PureSAT/SpO2
Adaptateur de capteur SpO2	NONIN	Référence 13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol Préparation à l’alcool, stérile, grand, 2 plis	Covidien	Référence 5110	Pour préparer la veine de l’oreille avant le cathétérisme
LabChart Pro (2019, version 8.1.16)	ADInstruments	n/a	Analyse ECG
Amplificateur quantique	Natus	Référence 13926	Amplificateur / numériseur
Amplificateur Quantum HeadBox	Natus	Référence 22134	Boîte de dérivation à 64 broches
Caméra PTZ 1080p SRG-X120 avec sortie HDMI, IP et 3G-SDI	Sony	SRG-X120	Caméra Impela