Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales de pigment oculaire à partir d’œil de lapin

Résumé

Source : Bascuas, T., et al. Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales de pigment primaire de mammifères pour la thérapie génique non virale. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure pour obtenir des cellules épithéliales pigmentaires oculaires à partir d’un modèle de lapin. Les cellules sont utiles dans le développement de stratégies thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Des lapins blancs néo-zélandais ont été euthanasiés par une surdose de Pentobarbital (150 mg/kg) dilué dans 0,9 % de NaCl injecté par voie intrapéritonéale et les yeux ont été énucléés immédiatement après le sacrifice.

1. Avant la préparation

1. Préparez un milieu complet (DMEM/F12 de Ham complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 80 U/mL de pénicilline, 80 μg/mL de streptomycine et 2,5 μg/mL d'amphotéricine B). Chauffer le milieu, 1x PBS et 0,25 % de trypsine (si nécessaire) dans un bain-marie à 37 °C.
2. Mettez un champ stérile dans la hotte pour préparer un lieu de travail aseptique. Introduisez tous les instruments et matériaux stériles nécessaires à l’intérieur de la hotte.
   note: Seules l’énucléation des yeux et le nettoyage des tissus musculaires et de la peau restants sont les procédures effectuées à l’extérieur de la capuche, le reste des étapes doit être effectué à l’intérieur de la capuche.

2. Isolement des cellules PE de lapin

1. Utilisez des ciseaux incurvés et une pince Colibri pour énucléer les yeux après l’euthanasie de l’animal. Nettoyez le tissu musculaire et la peau restants des yeux à l’aide de ciseaux et de pinces (non stériles).
   note: La taille des ciseaux et des pinces utilisés pour l’énucléation et le nettoyage des yeux dépend de l’espèce (par exemple, pour le rat et la souris, les instruments seront plus petits que ceux utilisés pour le porc et le bovin) (voir Figure 1).
   1. Prélever les yeux dans un tube de 50 mL rempli de PBS non stérile et transférer le tube dans la hotte à flux laminaire. Désinfectez les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, puis transférez-les dans une boîte de Pétri remplie de PBS stérile.
2. Ouverture de l’ampoule
   1. Placez un œil sur une compresse de gaze stérile et tenez-le fermement près du nerf optique. Ouvrez l’œil avec le scalpel #11 et des ciseaux à environ 2 mm sous le limbe. Retirez le segment antérieur (cornée, cristallin et iris) et mettez-le dans une boîte de Pétri. Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules EPR soient isolées.
3. Isolement des cellules IPE
   1. Retirez le cristallin et, à l’aide d’une pince fine, retirez délicatement l’iris contenant les cellules IPE. Placez l’iris dans une boîte de Pétri, lavez-le avec du PBS stérile et laissez-le dans le PBS jusqu’à ce que d’autres iris soient préparés. Retirez le corps ciliaire de l’iris en le coupant au scalpel #10.
   2. Après la préparation de 2 iris, incuber avec 1 mL de trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 10 min ; pendant ce temps, les cellules de l’EPR peuvent être isolées (voir étape 2.4). Retirer la trypsine et ajouter 1 mL de milieu complet dans l’iris et isoler les cellules en grattant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Remettez les cellules en suspension avec précaution par pipetage et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml. Prélever 10 μL de suspension cellulaire et diluer 1:3 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
   3. S’il n’est pas transfecté immédiatement, ensemencer 200 000 cellules/puits dans une plaque à 24 puits (100 000 cellules/cm²) dans 1 mL de milieu complet (10 % FBS) (pour l’ensemencement, voir le tableau 1). Placez la plaque dans un incubateur et cultivez-la à 37 °C, 5 % CO2.
      note: Il peut être nécessaire de regrouper plusieurs yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.
4. Isolement des cellules EPR
   1. Retirez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur à l’aide d’une pince fine. Évitez d’endommager l’épithélium pigmentaire rétinien.
   2. Mettez une gaze stérile dans une assiette à 12 puits et placez le bulbe sur la gaze.
   3. Laver avec du PBS. Ajouter 50 μL de trypsine à 0,25 % par œil et incuber pendant 10 min à 37 °C. Retirer la trypsine et ajouter 150 μL de milieu complet par globe et gratter délicatement les cellules EPR à l’aide d’une pipette Pasteur incurvée polie au feu ; Utilisez des pinces fines pour immobiliser le tissu. Prélevez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 ml. Prélever 10 μL de suspension cellulaire ; diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
   4. Centrifuger les cellules 10 min à 120 x g.
   5. S’il n’est pas transfecté immédiatement, ensemencer 200 000 cellules/puits dans une plaque à 24 puits (100 000 cellules/cm²) dans 1 mL de milieu complet (10 % FBS) (pour l’ensemencement, voir le tableau 1). Placez la plaque dans un incubateur et cultivez-la à 37 °C, 5 % CO2.
      note: Il peut être nécessaire de regrouper plusieurs yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.

Résultats

espèce	Traitement à la trypsine	N° cellules IPE	N° de cellules EPR	Plaque pour l’ensemencement (100 000 cellules/cm2)
lapin	oui	~350 000	~2 500 000	Plaques à 24 puits

Table...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques à 12 puits	Corning	353043
Plaques à 24 puits	Corning	353047
Bétadine	Mundipharma
Micro-pince Bonn plate
Pince Colibri (stérile)
DMEM/F12 de Ham	Sigma-Aldrich	D8062
Champ (stérile)	Mölnlycke Health Care	Référence 800530
FBS	Brunschwig	Réf. P40-37500
Pinces (de taille différente) (stériles)
Compresse de gaze	PROMEDICAL AG	Référence 25403
NaCl (0,9 %)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Chambre Neubauer	Marienfeld-supérieur	Référence 640010
Pipette Pasteur (polie au feu)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Pénicilline/streptomycine	Sigma-Aldrich	Réf. P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Pétri	ThermoFisher Scientific	150288
Scarpel n° 10	Swann-Morton	501
Scarpel n° 11	Swann-Morton	503
Ciseaux Bonn extra fins incurvés à pointe pointue (stériles)
Ciseaux Bonn extra fins (stériles)
Trypsine 0,25 %	ThermoFisher Scientific	25050014
Ciseaux à ressort Vannas courbés (stériles)