Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Avant la préparation
- Préparez un milieu complet (DMEM/F12 de Ham complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 80 U/mL de pénicilline, 80 μg/mL de streptomycine et 2,5 μg/mL d'amphotéricine B). Chauffer le milieu, 1x PBS et 0,25 % de trypsine (si nécessaire) dans un bain-marie à 37 °C.
- Mettez un champ stérile dans la hotte pour préparer un lieu de travail aseptique. Introduisez tous les instruments et matériaux stériles nécessaires à l’intérieur de la hotte.
REMARQUE : Seules l’énucléation des yeux et le nettoyage des tissus musculaires et de la peau restants sont les procédures effectuées à l’extérieur de la capuche, le reste des étapes doit être effectué à l’intérieur de la capuche.
- Les yeux de porc ont été obtenus d’un abattoir local dans les 6 heures suivant le sacrifice et ont été transportés au laboratoire sur de la glace
2. Isolement des cellules PE porcines
- Utilisez des ciseaux incurvés et une pince Colibri pour énucléer les yeux après l’euthanasie de l’animal. Nettoyez le tissu musculaire et la peau restants des yeux à l’aide de ciseaux et de pinces (non stériles).
note: La taille des ciseaux et des pinces utilisés pour l’énucléation et le nettoyage des yeux dépend de l’espèce (par exemple, pour le rat et la souris, les instruments seront plus petits que ceux utilisés pour le porc et le bovin) (voir Figure 1).
- Prélever les yeux dans un tube de 50 mL rempli de PBS non stérile et transférer le tube dans la hotte à flux laminaire. Désinfectez les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, puis transférez-les dans une boîte de Pétri remplie de PBS stérile.
- Après avoir transféré les yeux dans une boîte de Pétri stérile, tenez-en un fermement près du nerf optique avec un Colibri ou une pince pointue. Percez un trou près de la limite de l’iris (entre la pars plana et l’ora serrata) avec une aiguille de 18 G. Insérez de petits ciseaux dans le trou et coupez autour de l’iris. Retirez le segment antérieur (cornée, cristallin et iris) et mettez-le dans une boîte de Pétri. Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules EPR soient isolées.
3. Isolement des cellules IPE
- Retirez le corps ciliaire de l’iris en le coupant au scalpel #10. Après la préparation de 2 iris, ajoutez 1 mL de milieu complet et isolez les cellules en grattant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml. Prélever 10 μL de suspension cellulaire et diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre Neubauer.
- S’il n’est pas transfecté immédiatement, ensemencer 200 000 cellules/puits dans une plaque à 24 puits (100 000 cellules/cm2) dans 1 mL de milieu complet (10 % FBS) (pour l’ensemencement, voir le tableau 1). Placez la plaque dans un incubateur et cultivez-la à 37 °C, 5 % CO2.
note: Il peut être nécessaire de regrouper plusieurs yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.
4. Isolement des cellules EPR
- Effectuez l’étape 1.1.1. Placez l’ampoule dans une boîte de Pétri et lavez-la avec du PBS. Remplissez le bulbe avec 1 mL de milieu complet.
- À l’aide d’une pipette Pasteur incurvée polie au feu, retirez soigneusement les cellules EPR. Assurez-vous de gratter de bas en haut pour éviter de glisser vers le bas du complexe membranaire choroïde-Bruch. Prélever la suspension cellulaire à l’intérieur de l’ampoule à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et la transférer dans un tube de 1,5 mL pour la remise en suspension. Prélever 10 μL de suspension cellulaire et diluer 1:8 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre Neubauer.
- Cellules germes comme décrit à l’étape 3.2.
