Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE
1. Préparation d’un inoculum
- Verser 10 ml de bouillon LB dans une fiole conique de 50 ml munie d’un bouchon en mousse.
- Transvaser une colonie de la souche PAO1 ou de la souche PA14 de P. aeruginosa à partir d’une plaque de gélose fraîche et incuber à 37 °C pendant 3 à 4 h jusqu’à ce que les bactéries soient en phase mi-logarithmique.
- Transférez la culture de bactéries dans un tube de 50 mL et centrifugez-la à 3 000 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans du PBS.
- Répétez l’étape 1.3 deux fois de plus pour laver les cellules. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans du PBS et ajuster la densité optique à 600 nm à environ 0,6 en utilisant du PBS stérile comme blanc.
2. Infection du bouton cornéo-scléral
- Retirer le milieu de la boîte de Pétri et rincer les cornées deux fois avec 1 mL de PBS stérile.
- Serrez doucement la pince tout en tenant la cornée entre les deux. À l’aide d’un scalpel de 10 A, faites quatre incisions – deux verticales, deux horizontales – dans la section centrale du bouton cornéoscléral à travers la couche épithéliale jusqu’au stroma sous-jacent.
- Placez un moule en verre stérile dans une plaque à 6 puits avec la partie large vers le haut et placez la cornée au milieu du moule en verre, côté épithélium vers le bas. Faites la coupe au centre de la partie inférieure du moule en verre.
- ÉTAPE CRITIQUE : Verser 1 mL de gélose à faible point de fusion à 1 % (p/v) dissoute dans du DMEM pour remplir complètement le moule en verre de cornée.
- Laissez la gélose prendre, puis retournez le moule en verre de sorte que l’épithélium cornéen soit orienté vers le haut.
- Pipeter 15 μL de la culture bactérienne avec une DOde 600 nm = 0,6 (pour P. aeruginosa, cela équivaut à environ 1 x 107 unités formant colonie (UFC) dans 15 μL) directement dans une zone coupée, puis ajouter 85 μL de PBS sur le dessus pour maintenir l’épithélium cornéen humide. Diluez la culture bactérienne restante et placez une plaque sur une gélose pour compter les unités formant des colonies pour l’inoculum.
- Ajouter 1 mL de DMEM sans antibiotiques au fond de chaque puits avec le moule en verre. Incuber la plaque à 6 puits avec les boutons cornéoscléraux infectés dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h maximum.
- Mettez en place une cornée de contrôle non infectée à côté de chaque expérience. Pour mettre en place un contrôle non infecté, remplacez les 15 μL de culture bactérienne de l’étape 2.6 par du PBS stérile.
