Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dissection et infection de tissus pulmonaires de porc ex vivo (EVPL)
- Préparez un SCFM à utiliser avec des tissus EVPL, suivez la recette pour 1 L de SCFM modifié fournie dans le tableau 1.
- Avant la dissection, préparer une ou plusieurs plaques de gélose contenant la ou les souches bactériennes requises pour l’infection en utilisant la gélose standard en laboratoire pour P. aeruginosa/S. aureus (p. ex., bouillon de lysogénie + gélose à 1,2 %).
- Calculez le nombre de morceaux de tissu bronchiolaire porcin nécessaires pour l’expérience, y compris les morceaux de tissu témoin non infectés. Multipliez ce nombre par deux pour répéter l’expérience dans deux poumons répétés afin de confirmer la répétabilité des résultats.
- Multipliez le nombre total de morceaux de tissu requis par 0,5 pour déterminer le volume d’agarose SCFM (mL) nécessaire à la fabrication de tampons d’agarose pour produire suffisamment de milieu pour 400 μL/morceau de tissu, plus une gélose SCFM de rechange pour tenir compte des erreurs de pipetage ou de l’évaporation pendant la préparation.
- Ajouter 0,12 g d’agarose à chaque 15 mL de MGFS requis pour obtenir le volume total désiré de MGFS avec 0,8 % poids/volume d’agarose.
- Chauffer la solution d’agarose SCFM jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Un micro-ondes domestique à faible puissance est recommandé. Le temps nécessaire dépend de la puissance du micro-ondes. Laissez l’agarose refroidir à environ 50 °C (chaud au toucher mais confortable à tenir). Ne laissez pas refroidir davantage.
- À l’aide d’une pipette, ajoutez 400 μL d’agarose SCFM dans un puits d’une plaque de 24 puits par morceau de tissu nécessaire.
- Stérilisez la ou les plaques à 24 puits contenant de l’agarose SCFM sous une lumière ultraviolette pendant 10 min.
- Préparez trois répétitions de lavage pour chaque poumon intact disséqué à l'aide de 20 ml de milieu stérile modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) et de 20 ml de milieu stérile du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété par 50 μg/mL d'ampicilline.
- Faites une aliquote de 40 mL de SCFM comme lavage final pour chaque poumon intact disséqué. Tous les lavages peuvent être conservés toute la nuit à 4 °C ou utilisés immédiatement.
- Procurez-vous les poumons de la source désignée dès que possible après l’abattage, en veillant à ce qu’ils soient conservés au froid en les transportant au laboratoire dans une glacière domestique.
note: Les poumons plus proches du jour de l’abattage présentent moins d’ecchymoses lors de l’entreposage, mais les tissus conservés dans un entrepôt frigorifique jusqu’à 4 jours après l’abattage peuvent également être utilisés. Comme la glacière doit être apportée à la boucherie ou à l'abattoir, elle doit être décontaminée selon les directives du laboratoire local après chaque utilisation et entreposée à l'extérieur du laboratoire de microbiologie lorsqu'elle n'est pas utilisée, afin de réduire le risque de contamination et de bris de confinement.
- En travaillant sur une surface stérilisée et sous une flamme, placez les poumons sur une planche à découper en plastique propre recouverte de papier d’aluminium autoclave. Vérifiez que les bronchioles restent intactes. S’il y a eu des dommages à l’abattoir ou pendant le transport, les poumons ne sont pas adaptés à l’utilisation.
- Chauffez un couteau à palette sous une flamme et touchez très brièvement le couteau à la zone du poumon entourant la bronchiole pour stériliser la surface du tissu.
- Coupez le tissu superficiel entourant la bronchiole à l’aide d’une lame de rasoir stérile montée. Faites des incisions parallèles à la bronchiole pour éviter tout dommage.
- Une fois la bronchiole exposée, faites une incision transversale à travers la bronchiole au point le plus haut visible pour libérer la bronchiole.
- À l’aide d’une pince stérile, tenez légèrement l’extrémité libre de la bronchiole et coupez tout tissu indésirable restant à l’aide d’une lame de rasoir stérile montée. Faites une dernière incision transversale à travers la bronchiole avant qu’une ramification ne soit visible pour retirer la bronchiole des poumons.
- Placez les bronchioles dans le premier lavage DMEM/RPMI 1640. Laissez la bronchiole dans le lavage et répétez les étapes 1.12 à 1.15 pour prélever d’autres sections de bronchiole dans le même poumon si nécessaire afin d’obtenir suffisamment de coupes de tissu pour l’expérience prévue.
- Placez toutes les sections bronchiolaires supplémentaires du même poumon dans le lavage (étape 1.17). Laisser au lavage pendant au moins 2 min.
- Retirez les bronchioles du premier lavage DMEM/RPMI 1640 et placez les échantillons dans une boîte de Pétri stérile.
- Tenez légèrement chaque bronchiole à l’aide d’une pince stérile, en veillant à ne pas endommager les tissus. Retirez autant de tissus mous restants que possible et coupez le tissu en bandes de ~5 mm de large à l’aide de ciseaux de dissection stériles.
- Placez toutes les bandelettes de tissu bronchiolaire dans le deuxième lavage DMEM/RPMI 1640. Laisser au lavage pendant au moins 2 min.
- Retirez les bandes de tissu du deuxième lavage à l’aide d’une pince stérile, en prenant soin de ne pas endommager le tissu. Placez le mouchoir dans une boîte de Pétri propre et stérile.
- Retirez tout tissu mou restant attaché à la bronchiole et coupez les bandes en carrés (~5 mm x 5 mm) à l’aide de ciseaux de dissection stériles.
- Ajoutez le troisième lavage DMEM/RPMI 1640 dans la boîte de Pétri. Mélangez légèrement les morceaux de mouchoir au lavage en remuant le plat.
- Versez le troisième lavage de la boîte de Pétri sans retirer les morceaux de tissu.
- Ajoutez le dernier lavage SCFM dans la boîte de Pétri contenant du tissu, en vous assurant que tous les morceaux de tissu sont couverts.
- Stérilisez les morceaux de tissu dans SCFM sous une lumière UV pendant 5 min.
- À l’aide d’une pince stérile, transférez chaque morceau de tissu bronchiolaire stérilisé dans les puits individuels d’une ou plusieurs plaques de 24 puits contenant des coussinets d’agarose SCFM.
- Pour infecter chaque morceau de tissu avec la souche bactérienne souhaitée, touchez une colonie cultivée sur une plaque de gélose avec la pointe d’une aiguille de 29 G fixée à une seringue d’insuline stérile de 0,5 ml. Touchez ensuite la colonie sur le morceau de tissu, en piquant doucement la surface du tissu.
note: L’utilisation d’une seringue à insuline équipée d’une aiguille de 29 G permet de tenir l’aiguille avec précision et confort tout en gardant les doigts à une distance de sécurité de l’aiguille et du tissu pulmonaire. Il est possible d’effectuer cette étape à l’aide d’aiguilles de 29 G qui ne sont pas attachées à une seringue, mais cela nécessite une plus grande dextérité et augmente le risque de blessure par piqûre d’aiguille. Des seringues à insuline sont facilement disponibles.
- Pour les témoins non infectés, piquer doucement la surface de chacun des morceaux de tissu à l’aide de la pointe d’une aiguille de 29 G fixée à une seringue d’insuline stérile de 0,5 ml.
- À l’aide d’une pipette, ajoutez 500 μL de SCFM dans chaque puits.
- Stérilisez une membrane d’étanchéité respirante pour chaque plaque de 24 puits sous une lumière ultraviolette pendant 10 min (tableau des matériaux).
- Retirez le(s) couvercle(s) de la (des) plaque(s) à 24 puits et remplacez-les par la membrane respirante.
- Incuber les plaques à 37 °C pendant le temps d’incubation (infection) souhaité sans agiter. Vérifier qu’il n’y a pas de croissance visible de l’agent pathogène inoculé sur les pièces témoins non infectées (contrôle de la contamination).
note: Si vous le souhaitez, on peut ajouter de l’ampicilline aux coussinets d’agarose SCFM et recouvrir la SCFM à l’étape 1.31 jusqu’à une concentration finale de 20 μg/mL. Cela supprimera la croissance de la plupart des bactéries endogènes sur les poumons sans affecter la croissance de P. aeruginosa ou de S. aureus, mais, comme la présence d’ampicilline peut affecter la sensibilité à d’autres antibiotiques, le lecteur est laissé à faire ce choix en fonction des souches et des antibiotiques qu’il souhaite tester.
TABLEAU 1
1. Préparation de milieux d’expectoration CF synthétiques (SCFM) pour utilisation avec un modèle de poumon de porc ex vivo
Une fois fabriqué, le SCFM doit être stérilisé par filtre, puis peut être stocké à 4°C pendant un mois maximum.
| a) Recette principale |
| Étape 1 | chimique | quantité | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| NaCl | 3,03 grammes | Ajouter des sels et de l’eau à la bouteille propre, utilisé uniquement pour la préparation de la SCFM | 51,85 |
| Kcl | 1,114 g | 14,94 |
| dH2O | 640 ml | n/a |
| Étape 2 | chimique | Molarité du stock fabriqué dans l’eau, stérilisé par filtre et stocké à 4°C | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| Na2HPO4 | 0,125 M | Ajouter 10 ml de chaque bouillon aux sels et à l’eau préparés à l’étape 1 | 1,25 |
| NaH2PO4 | 0,13 M | 1,30 |
| NH4Cl | 0,228 million d’habitants | 2,28 |
| KNO3 | 0,0348 million d’habitants | 0,35 |
| K2SO4 | 0,0271 million d’habitants | 0,27 |
| Vadrouilles | 1 M | 10.00 |
| Étape 3 | chimique | | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| 19 solutions d’acides aminés préparées conformément à la section B) | Ajouter 10 ml de chaque bouillon à la solution préparée aux étapes 1 et 2. | Voir section b) |
| Étape 4 | Chimique | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| HCl ou NaOH selon les besoins | Utiliser pour ajuster le pH de la solution préparée aux étapes 1-3 à 6,8. Enregistrer le volume d’acide/base ajouté. | n/a |
| Étape 5 | Chimique | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| dH2O | Ajouter à la solution préparée aux étapes 1 à 4, jusqu’à un volume final de 960 ml | n/a |
| Étape 6 | chimique | Molarité du stock fabriqué dans l’eau, stérilisé par filtre et stocké à 4°C | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| CaCl2 | 0,175 M | Ajouter 10 ml de chaque pâte à la solution préparée aux étapes 1 à 5 | 1,75 |
| MgCl2 | 0,0606 million d’habitants | 0,61 |
| Étape 7 | chimique | Molarité du stock fabriqué dans l’eau, stérilisé par filtre et stocké à 4°C | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| Acide L-lactique | 0,93 M | Préparez le bouillon dans de l’eau, pH à 7 avec 5M de NaOH. Ajouter 10 ml à la solution préparée aux étapes 1 à 6. | 9 h 30 |
| Étape 8 | chimique | Molarité de la matière de travail faite dans l’eau, immédiatement avant l’ajout à la recette | instructions | Finale mM en 1L SCFM |
| Fe(III)SO4.7H2O | 0,00036 M | Fabriquer un matériau mère de 0,036 M, qui peut être stérilisé par filtre et stocké à 4 °C tant que la solution reste exempte de précipité. Pour fabriquer la matière première, ajoutez 110 μl de la matière première à 9,890 ml de dH2O et ajoutez la matière première à la solution préparée aux étapes 1 à 7. | 0,0036 |
| b) Préparation des stocks d’acides aminés ; filtrer, stériliser avant utilisation et conserver à 4°C. |
| acide aminé | stock mM | instructions | mM final en 1 L SCFM |
| alanine | 178 | Dissoudre dans l’eau | 1,780 |
| arginine | 30,6 | Dissoudre dans l’eau | 0,306 |
| Aspartate | 82,7 | Dissoudre dans 0,5 M NaOH | 0,827 |
| cystéine | 16 | Dissoudre dans l’eau | 0,160 |
| acide glutamique | 154,9 | Dissoudre dans 1 M HCl | 1,549 |
| glycine | 120,3 | Dissoudre dans l’eau | 1,203 |
| histidine | 51,9 | Dissoudre dans l’eau | 0,519 |
| isoleucine | 112.1 | Dissoudre dans l’eau en chauffant à 50°C pendant 30 minutes sur un shaker | 1.121 |
| leucine | 160,9 | Dissoudre dans l’eau | 1,609 |
| lysine | 212,8 | Dissoudre dans l’eau | 2.128 |
| méthionine | 63,3 | Dissoudre dans l’eau | 0,633 |
| Ornithine-HCl | 67,6 | Dissoudre dans l’eau | 0,676 |
| phénylalanine | 53 | Dissoudre dans l’eau | 0,530 |
| proline | 166 | Dissoudre dans l’eau | 1.660 |
| sérine | 144,6 | Dissoudre dans l’eau | 1,446 |
| thréonine | 107,2 | Dissoudre dans l’eau | 1,072 |
| tryptophane | 1.3 | Dissoudre dans 0,2 M de NaOH | 0,013 |
| tyrosine | 80,2 | Dissoudre dans 1M NaOH | 0,802 |
| valine | 111,7 | Dissoudre dans l’eau | 1.117 |
