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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dissection de tissu
- Préparez le tissu porcin à l’aide d’un espace de travail de dissection non stérile.
- Procurez-vous des yeux de porc énucléés auprès d’un abattoir local, d’études animales ou d’un fournisseur. Maintenez les yeux sur de la glace immergée dans du PBS pendant l’accouchement et utilisez-le immédiatement dès réception.
- Coupez le tissu extraorbitaire et coupez la conjonctive en ne laissant que la coquille cornéo-sclérale et le nerf optique. Effectuez la dissection dans des conditions non stériles avec de grands ciseaux chirurgicaux et des pinces dans un paquet d’outils de dissection grossière.
- Remettez les yeux dans du PBS frais sur de la glace jusqu’à ce que tous les yeux nécessaires à la configuration expérimentale aient été disséqués de manière préliminaire ou grossière.
- Immerger les yeux dans une solution de bétadine à 10 % pendant 2 min dans des récipients fermés et transférer aseptiquement dans l’armoire BSC II pour la microdissection (armoire #1). Effectuez tous les travaux ultérieurs dans des conditions stériles afin de minimiser les contaminations lors de l’installation.
- Disséquer stérilement les segments antérieurs.
- Après 2 minutes dans une solution de bétadine, transférez les yeux dans trois lavages en série de 1x antibiotique-antimycotique-PBS stérile (AA-PBS) pour éliminer l’excès de solution de bétadine de la surface oculaire tout en maintenant la stérilité du tissu oculaire. Après trois lavages, maintenez le mouchoir dans AA-PBS jusqu’à ce qu’il soit utilisé à nouveau.
- Émissez l’œil à l’aide d’une lame de rasoir/scalpel et de ciseaux incurvés. Placez l’œil sur une gaze imbibée d’AA-PBS et créez une incision avec une lame de rasoir stérile ou un scalpel près de l’équateur de l’œil (division 60/40 avec 40 sur la face antérieure). À l’aide de ciseaux chirurgicaux incurvés, hémisectez l’œil pour isoler l’œil antérieur (moitié cornéenne).
note: La coupe autour du segment antérieur doit être continue pour éviter les bords déchiquetés et rugueux de la sclérotique qui créeront des fuites de liquide après l’installation dans la culture de l’organe.
- Utilisez des microciseaux comme pelle pour prélever l’humeur vitrée du segment antérieur. Retirez le cristallin du segment antérieur à l’aide de microciseaux. Laissez les segments antérieurs dans l’AA-PBS jusqu’à ce que d’autres étapes de dissection soient effectuées.
note: Tous les yeux qui seront disséqués peuvent être tenus à cette étape et un par un à travers le reste du processus de dissection.
- À l’aide d’un microscope à dissection, coupez l’iris à la racine de l’iris progressivement, radialement jusqu’à ce que le réseau trabéculaire (TM) soit visible. Le TM est un tissu pigmenté qui comprend des fibres orientées circonférentiellement autour de la coquille cornéosclérale. Des coupes soigneuses dans l’iris vers la racine de l’iris exposeront la profondeur de la TM sous le tissu.
- Coupez à 360° autour de l’iris à la même profondeur que la coupe initiale dans le tissu pour exposer toute la région TM. Nettoyez si nécessaire tout résidu résiduel de revêtement d’iris TM.
- Coupez les restes du corps ciliaire à l’arrière de la TM, ne laissant qu’une fine bande de tissu à l’arrière de la région de la TM (environ 1 mm).
- Placez le segment antérieur (SA) disséqué dans le milieu jusqu’à ce qu’il soit mis en place dans la culture d’organe du segment antérieur (ASOC) dans l’armoire BSC II (armoire #2).
note: Tous les yeux peuvent être maintenus à ce stade avant la configuration de l’ASOC si un seul utilisateur effectue une dissection et un assemblage de la boîte de culture d’organes.