Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Mise en place des segments antérieurs dans les boîtes de culture d’organes
- Placez un seul segment antérieur (SA) dans une boîte de Pétri avec AS inversé (tasse vers le haut). À l’aide d’un coton-tige, mouillez dans le support et tamponnez doucement au centre de la cornée pour éliminer tout pigment. À l’aide d’une pince pour tenir l’œil et du même écouvillon, essuyez le coton-tige autour de la sclérotique pour éliminer l’excès de pigment.
- Inversez l’AS et placez-le sur la partie inférieure de la boîte sur la région surélevée, en centrant la cornée sur la région élevée de la boîte. Placez la bague de serrage sur l’AS nouvellement placé.
- Placez quatre vis dans les trous correspondants pour maintenir l’anneau en place avec l’AS sous l’anneau. Serrez doucement les vis à la main avec la clé L.
note: L’étape de serrage se fera quotidiennement tout au long de l’expérience, de sorte que l’objectif du serrage initial ici est de s’assurer que le média ne fuit pas tout en évitant de casser la bague de serrage.
- Avec un ensemble de boîtes de Pétri stériles, placez le dessus sur le plat et inversez la configuration. Fixez le support à plat. Fixez les connecteurs fluidiques avec des joints toriques aux ports filetés au bas de la parabole.
- À un connecteur fluidique, fixez un moyeu d’aiguille courbée à 90° de 18 G, une longueur de tube, un moyeu d’aiguille de 18 G, un filtre de seringue en nylon, une valve à trois voies et une seringue de 20 mL remplie de média.
- Au deuxième connecteur fluidique, fixez un moyeu à aiguille courbée à 90° de 18 G, une longueur de tube, un moyeu à aiguille de 18 G, une valve à trois voies et la partie cylindrique d’une seringue stérile de 10 ml (cela agira comme un réservoir pour récupérer le liquide et les bulles de l’ASOC).
- Avec les vannes à trois voies ouvertes de manière appropriée aux seringues, poussez doucement le fluide à travers le système à l’aide de l’orifice de connecteur fluidique identifié à l’étape 1.5 pour gonfler l’AS, remplir le fluide dans le tube et éventuellement le réservoir.
note: En cas de fuite de fluide dans la parabole ASOC, l’AS n’est pas suffisamment fixé avec la bague de serrage.
- Éliminez les bulles en poussant doucement le média dans le plat et en inversant le plat pour repousser les bulles dans le réservoir.
- Placez le plat et tenez-vous debout. Placez la partie inférieure d’une boîte de Pétri sous les pieds du support, en prenant soin de ne pas coincer le tube.
2. Démarrage de la culture d’organes du segment antérieur
- L’ASOC est maintenant prêt pour l’incubation. Placez la parabole ASOC dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2). Assurez-vous que la hauteur de la parabole ASOC dans l’incubateur au-dessus des transducteurs de pression est connue et prise en compte pour calculer avec précision la pression intraoculaire (PIO).
- Dirigez les conduites de tubes vers l’extérieur par le bas de la porte de l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 afin qu’elles n’interfèrent pas avec l’ouverture et la fermeture de la porte. Fixez la seringue de 20 ml au seringue-pompe réglé à 2,5 μL/min.
- Positionnez la conduite de tuyauterie avec le réservoir au niveau de l’instrument du transducteur de pression. Connectez la vanne latérale à 3 voies à la configuration du transducteur de pression tout en faisant circuler le PBS dans la conduite pour éviter que des bulles d’air ne pénètrent dans les conduites de tuyauterie.
note: Vider le PBS des réservoirs après la mise en place du système afin de réduire la probabilité de contamination du réservoir par la croissance microbienne pendant la durée de la culture de l’organe.
- Lancez la collecte de données IOP en vous assurant d’abord qu’une carte microSD est présente pour enregistrer les fichiers de données. Ensuite, activez la configuration du transducteur de pression pour commencer la collecte de données.
3. Entretien quotidien de l’ASOC
- Après que l’ASOC ait eu 24 h pour s’équilibrer, retirez les plats de l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 et placez-les dans l’armoire de biosécurité (BSC) II.
note: Lors de l’acquisition des données de pression, ces périodes ressemblent à des pics lorsque les ASOC sont retirés de l’incubateur (changement de hauteur) et ajustés dans l’armoire.
- Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites sous chaque plat de la plaque de Pétri. Le cas échéant, vérifiez que les connexions fluidiques sont bien serrées sous la parabole et resserrez si nécessaire. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites dans le dessus de la parabole à l’aide d’une clé coussale stérile pour serrer les vis de la bague de serrage.
note: Le tissu de la sclérotique AS se comprimera et réduira son épaisseur de 24 h, et la bague de serrage devra être serrée.
- Aspirez bien le fluide du plat.
note: Le réseau trabéculaire filtre le fluide du média pompé dans l’ASOC. Par conséquent, des fluides seront présents dans la parabole ASOC le long des bords.
- Répétez les étapes 1.7 et 1.8 pour éliminer les bulles d’air emprisonnées.
- Remplissez les seringues sur les pousse-seringues, assurez-vous que les pousse-seringues fonctionnent et confirmez l’alignement des valves pour la perfusion dans l’ASOC. Remettez la parabole ASOC dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
note: Idéalement, ces étapes doivent être effectuées quotidiennement. Cependant, l’utilisation d’un volume de départ de 20 mL de fluide, du volume du puits de la parabole ASOC et d’un débit de pompe de 2,5 μL/min devrait être suffisante pour permettre au système de fonctionner pendant plusieurs jours sans être dérangé.
