Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Tranchage du tissu du cœur de porc
- Installez le bain de tissus sur le vibratome, ajoutez de la glace dans l'enveloppe de refroidissement du bain de tissus, puis ajoutez la solution de Tyrode dans le bain de tissus. Installez un bocal en plastique de 1 L pour recueillir l’élimination de la glace fondue de l’enveloppe réfrigérante du bain de tissus. Pour 1 L de la solution de tranchage de Tyrode, mélanger 3 g/L de 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g), 6 mM de KCl (0,447 g), 10 mM de D-glucose (1,86 g), 10 mM d'HEPES (2,38 g), 1 mM de MgCl2 (1 mL de solution 1 M), 1,8 mM de CaCl2 (1,8 mL de solution 1 M), jusqu’à 1 L de ddH2O. Ajustez le pH à 7,40 à l’aide de NaOH. Ensuite, filtrez la solution à l’aide d’un système de filtration/stockage sous vide de 1 000 mL, 0,22 μm, et conservez-la à 4 °C pendant la nuit.
- Sous l’enceinte de biosécurité, transférez le cœur de porc dans un plateau contenant 1 L de solution cardioplégique fraîche et froide. Pour 1 L de solution cardioplégique, mélanger 110 mM de NaCl (6,43 g), 1,2 mM de CaCl2 (1,2 mL de solution 1 M), 16 mM de KCl (1,19 g), 16 mM de MgCl2 (3,25 g), 10 mM de NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL d’héparine, jusqu’à 1 L de ddH2O. Ajustez le pH à 7,40 à l’aide de NaOH. Ensuite, filtrez la solution à l’aide d’un système de filtration/stockage sous vide de 1 000 mL, 0,22 μm, et conservez-la à 4 °C pendant la nuit><.
note: Ajoutez 1 000 U/L d’héparine dans une solution pour cardioplégie le jour de l’émincation.
- Disséquez le cœur pour isoler le ventricule gauche à l’aide de scalpels stériles rétractables. Ensuite, coupez le ventricule gauche en blocs de 1 à 2 cm3 chacun à l’aide de lames rectangulaires de rasoir. Utilisez un morceau pour trancher et conservez les morceaux restants dans un tube de 50 ml dans la solution froide de Tyrode sur de la glace pour les couper plus tard, si nécessaire.
note: Massez le mouchoir avant de trancher avec les mains, surtout s’il s’agit du deuxième bloc. Le massage aide à rétablir la bonne configuration des fibres musculaires et prévient toute raideur à l’intérieur du bloc cardiaque.
- Ajoutez 1 à 2 gouttes de colle à tissu (tableau des matériaux) dans le porte-échantillon en métal et collez un morceau du bloc de gélose à 4 % d’une surface d’environ 1cm2.
- Ajoutez 1 à 2 gouttes de colle de tissu sur l’agar.
- Collez le bloc cardiaque sur la gélose avec le côté de l’épicarde cardiaque vers le bas sur la colle tissulaire et assurez-vous qu’il est aussi plat que possible. Ensuite, transférez le support de tissu avec le bloc cardiaque dans sa position dans le bain de tranchage du vibratome.
- Fixez le tube d'oxygène au bain de tranchage et au plateau métallique rempli de la solution de Tyrode pour recueillir les tranches (bain de Tyrode oxygéné). Ensuite, ajoutez des passoires de cellules de 40 μm dans le plateau métallique pour recueillir les tranches après la coupe.
- Réglage de la position de tranchage
- À l’aide du logiciel d’exploitation du vibratome et du tableau de bord, ajustez la hauteur de la lame/de l’échantillon. Sélectionnez le bouton de hauteur et suivez les instructions à l’écran pour régler la hauteur. Idéalement, placez la lame près du haut du tissu mais en dessous des muscles papillaires et assurez-vous qu’il y a du liquide recouvrant le tissu et la lame avant de trancher.
- Ajustez l’endroit où commencer à trancher le mouchoir en papier en sélectionnant le bouton d’avance. Appuyez sur le bouton slice et augmentez la vitesse à l’aide du bouton pour déplacer la lame vers le bord du tissu. Ensuite, appuyez à nouveau sur la tranche pour arrêter, puis appuyez sur le bouton d’avance pour désactiver le processus.
- Ajustez les paramètres de coupe : vitesse d’avance = 0,03 mm/s, fréquence de vibration = 80 Hz et amplitude de vibration horizontale = 2 mm. Ensuite, commencez à trancher en sélectionnant le bouton de tranche.
- Laissez le vibratome trancher jusqu’à ce qu’il atteigne l’extrémité du tissu, mais avant qu’il n’atteigne l’extrémité arrière du porte-échantillon. À ce stade, appuyez à nouveau sur la touche Slice pour arrêter. Appuyez sur le bouton Retour pour revenir à la position de départ.
- Sélectionnez la répétition automatique (en cliquant deux fois) qui permettra au microtome vibrant de répéter automatiquement le processus de tranchage jusqu’à 99 fois.
- Collecte des tranches
- Attendez que les tranches soient de pleine longueur et semblent bonnes (après avoir dépassé les couches de muscle papillaire), puis commencez à collecter les tranches.
- Prélevez les tranches à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique remplie de solution froide de Tyrode pour saisir doucement le tissu du bain. Si nécessaire, utilisez des pinces et des ciseaux à ressort pour dissocier la tranche du bloc cardiaque si le tissu est toujours attaché.
- Transférez la tranche dans une passoire cellulaire dans le bain de Tyrode oxygéné (voir étape 1.7) et utilisez le liquide dans la pipette Pasteur en plastique pour que le tissu repose à plat sur l'une des crépines cellulaires, puis ajoutez une rondelle métallique sur le dessus pour maintenir le tissu vers le bas.
