Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement des complexes cumulus-ovocytes porcins
- Pour collecter du matériel pour l’isolement des follicules ovariens, excisez les ovaires porcins des cochettes prépubères (âgées d’environ 6-7 mois, pesant 70 à 80 kg) dans un abattoir local. Choisissez environ 20 ovaires de porc parmi 10 animaux pour l’isolement des complexes cumulus-ovocytes (COC) dans chaque expérience.
note: En supposant que chaque ovaire produit 3 à 5 follicules, le nombre total de follicules varie de 60 à 100.
- Placez les ovaires dans un thermos avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4 ; 38 °C) contenant une solution antimycosique à 1 % (SAA). S’assurer que le matériel expérimental est transporté au laboratoire dans un délai de 1 h où il est rincé deux fois avec du PBS stérile contenant des antibiotiques.
- Après avoir rincé les ovaires, transférez-les dans le bécher rempli de milieu de manipulation (HM) (Table des matériaux) et stockez-les dans un incubateur à 38 °C pendant la durée de toutes les manipulations.
note: Pour des résultats optimaux lors de la manipulation des ovocytes, effectuez toutes les procédures en milieu DMEM/F12 (milieu de manipulation, HM) avec l’ajout de 2,5 % d’antibiotiques/AAS et de 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et contrôlez le pH au niveau de CO2 dans l’environnement, sur une table chauffante avec contrôle de la température (38 °C) et sous la hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination bactérienne.
- À partir de gros follicules porcins (6 à 8 mm de diamètre), prélever le liquide folliculaire (FF) par aspiration et centrifugation à 100 x g pendant 10 min à température ambiante. Après cela, filtrez le surnageant à l’aide d’une seringue stérile fixée à des filtres à pores à membrane de 0,2 μm et congelez-le à -80 ° C.
note: Utilisez une seringue à insuline (u-40) pour l’aspiration du liquide folliculaire.
- Assurez-vous que seuls des follicules sains de taille moyenne (4 à 6 mm de diamètre) sont sélectionnés pour l’isolement des COC.
note: Les COC de grade I, possédant un ovocyte intact et rond avec un ovoplasme homogène et des cumulus compacts multicouches (au moins 3-4) sont considérés comme appropriés pour une procédure ultérieure de MIV 3D.
- Pour isoler les COC, transférez 2 à 3 ovaires dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm de diamètre remplie de HM. Isolez les COC des follicules de taille moyenne en suivant l’une des procédures ci-dessous.
- Coupez doucement la surface des follicules ovariens saillants à l’aide d’une lame chirurgicale stérile 15C. Cela fera couler le liquide folliculaire ainsi que les COC dans la boîte de Pétri.
- Aspirez le contenu folliculaire à l’aide d’une aiguille de 28 G d’une taille de 5/8" attachée à une seringue jetable et transférez-la dans la boîte de Pétri.
note: Jetez les restes de tissu ovarien. Les étapes ultérieures de l’isolement sont réalisées au stéréomicroscope.
- Préparez 3 à 5 boîtes de Pétri FIV de 60 mm.
- Ajoutez 1 mL de HM dans les puits centraux et placez 3 à 4 gouttes de HM (50 μL par goutte) dans leurs anneaux extérieurs.
- Ensuite, à l’aide d’une micropipette en polycarbonate, déplacez les COC non endommagés en gouttes de HM dans les anneaux extérieurs pour les rincer brièvement 3 à 4 fois.
- À la fin, transférez-les individuellement dans le puits central. Conservez ces plaques de FIV dans un incubateur pour d’autres procédures.