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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Encapsulation dans des microbioréacteurs super-hydrophobes à l’éthylène propylène fluoré (FEP).
REMARQUE : Assurez-vous que toutes les procédures de maturation in vitro (IVM) sont effectuées sur une table thermostatique, et que les complexes cumulus-ovocytes (COC) sont maintenus à 38 °C tout au long de leur manipulation.
- Préparez une boîte de Pétri de 30 mm contenant 5 g de FEP sur lit de poudre, taille moyenne des particules de 1 μm
REMARQUE : Il est important d’utiliser de la poudre de FEP fraîche. Le FEP réutilisé a tendance à s’agréger et à former des grumeaux.
- Répartissez une seule gouttelette de milieu de maturation (MM) (~30 μL de volume) contenant 3 à 5 COC sur le lit de la poudre de FEP. Faites pivoter doucement la plaque dans un mouvement circulaire pour vous assurer que ces particules recouvrent complètement la surface de la goutte de liquide et des billes liquides formées (LM).
- Prélever le LM formé à l’aide d’une pipette avec une pointe de 1 000 μL.
REMARQUE : Coupez la pointe de la pipette sur le bord pour l’adapter au diamètre du LM (4-5 mm). Le diamètre approximatif d’une telle pointe préparée doit être légèrement plus grand que celui du LM.
- Préparez plusieurs boîtes de Pétri de fécondation in vitro (FIV) de 60 mm. Ajoutez 3 à 4 ml d’eau stérile dans les anneaux extérieurs pour préparer la chambre d’humidité. Ensuite, placez un LM dans le puits central.
REMARQUE : Cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de la précision - si la bille est placée négligemment ou tombe même d’une faible hauteur, elle sera détruite.
- Incuber les billes pendant 4 jours à 38 °C dans un incubateur à 5 % de CO2.
- Changer de milieu quotidiennement en suivant la procédure : appliquer 30 μL de MM sur chaque LM, ce qui provoquera leur étalement car le contact direct avec le liquide perturbe l’hydrophobicité des poudres FEP enrobées. Lorsque la teneur en marbre se dissout, transférez les COC libérés du bioréacteur à une goutte de MM frais dans la boîte de Pétri.
REMARQUE : Pour transférer avec précision les COC libérés, utilisez une micropipette en polycarbonate.
- Après plusieurs lavages en MM (3-4 fois) pour éliminer les particules de FEP, transférez-les avec 30 μL de MM frais sur le lit de poudre FEP. Faites pivoter doucement la plaque dans un mouvement circulaire pour vous assurer que les particules de poudre recouvrent complètement la surface de la goutte de liquide et forment un nouveau LM.
- Prélever le LM formé à l’aide d’une pipette avec une pointe de 1 000 μL.
- Ajoutez 3 à 4 ml d’eau stérile dans les anneaux extérieurs pour préparer la chambre d’humidité. Ensuite, placez un LM dans le puits central de la boîte de Pétri FIV.
REMARQUE : Le revêtement transparent de la poudre FEP permet de surveiller la teneur en LM à l’aide d’un microscope optique.