Ablation sélective assistée par laser des cellules endothéliales cornéennes porcines : une technique pour induire des lésions endothéliales cornéennes porcines focalisées pour des études ex vivo

Dans cet article

Résumé

Source : Holzhey, A. et al., Développement d’un modèle expérimental non invasif, assisté par laser, de perte de cellules endothéliales cornéennes. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente une procédure non invasive assistée par laser pour endommager sélectivement les cellules endothéliales cornéennes de l’œil porcin. Le modèle ex vivo développé des lésions des cellules endothéliales peut être utilisé pour étudier les maladies de l’endothélium cornéen.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la culture d’organes et traitement au laser

Obtenez des yeux de porc fraîchement énucléés de l’abattoir local. Conservez-les au frais (4 °C) dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose, complété par de la L-glutamine, du pyruvate de sodium, de la pénicilline/streptomycine (1 %) et du sérum porcin (10 %), ci-après désigné dans cet article comme milieu complet.
Retirez les tissus extracellulaires avec des ciseaux et trempez les yeux dans une solution ophtalmique de povidone iodée à 5 % pendant 5 minutes avant de les placer dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérilisée jusqu’à utilisation.
Dépister les yeux pour détecter les principales pathologies du segment antérieur, telles que les cicatrices cornéennes, l’œdème et d’autres opacités à l’aide d’un appareil de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (Table des matériaux).
Placez les yeux devant une unité de lampe à fente équipée d’un laser Nd :YAG (Table of Materials), qui a une longueur d’onde de 1 064 nm et un diamètre de point focal de 10 μm dans l’air.
note: Pour un positionnement optimal, un appareil de maintien imprimé en 3D est utilisé, conçu pour maintenir l’œil ferme, sans exercer trop de pression sur celui-ci (Figure 1).
Utilisez un grossissement de 12x et déviez l’éclairage pour visualiser les différentes couches cornéennes.
Réglez l’énergie d’impulsion (par exemple, 1,6 mJ) et le point focal (par exemple, 0,16 mm) pour l’ablation sélective des cellules endothéliales.
Placez une paracentèse cornéenne claire près du limbe et injectez du viscoélastique (Table des matériaux) pour stabiliser la chambre antérieure.
Exciser la cornée centrale traitée au laser à l’aide d’un trépan de 8 mm.
Placez la cornée excisée dans un puits d’une plaque à 12 puits avec le site endothélial vers le haut et incubez l’échantillon dans 3 mL de milieu complet à 37 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 3 jours.
note: Des agents cytoprotecteurs potentiels peuvent être ajoutés au milieu au cours de cette étape.

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Résultats

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Figure 1 : Dispositif expérimental.(A) Les yeux ont été fixés dans un appareil de maintien partiellement imprimé en 3D, ce qui a permis un alignement précis par rapport au faisceau laser. (B) Avant le traitement au laser, le tissu a été évalué à l’aide d’un appareil de tomographie par cohérence optique du segment antérieur afin de vérifier la présence de patho...