Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement des cellules endothéliales aortiques porcines
- Dans des conditions aseptiques, retirer l’aorte du porc du tampon de lavage et la placer sur une boîte de Pétri de 150 mm (figure 1A).
- Coupez doucement les deux extrémités de l’aorte et excisez l’excès de tissu autour de l’aorte à l’aide d’une pince stérile et de ciseaux (figure 1B). Laver l’extérieur et l’intérieur de l’aorte (au-dessus de la boîte de culture à température ambiante) avec 20 à 50 ml de tampon de lavage : 1 solution PBS (pH 7,4) avec 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine
note: Essayez de ne couper que la zone où les pinces ont été placées pendant l’opération, car certains EC ont été endommagés dans cette zone, et retirez les tissus en excès et les branches latérales artérielles.
- Passez une suture chirurgicale dans l’aorte, puis attachez une extrémité de l’aorte à l’aide de la suture chirurgicale (5-0, 90cm, Table des matériaux). Conservez la suture chirurgicale à l’intérieur de l’aorte (Figure 1C, D).
- Fixez doucement l’aorte près de l’extrémité attachée à l’aide d’une pince, puis tirez lentement sur la suture chirurgicale pour inverser l’aorte jusqu’à ce que la surface endothéliale de l’aorte soit exposée (Figure 1E−G).
note: Assurez-vous de fixer l’aorte près de l’extrémité attachée et ne fixez pas l’aorte fermement, sinon l’aorte ne peut pas être inversée en tirant sur la suture chirurgicale.
- Lavez la surface endothéliale de l’aorte avec un tampon de lavage 3 fois (10 mL par lavage), puis jetez cette solution. Placez l’aorte dans un tube à centrifuger de 15 ml et recouvrez l’aorte de 10 ml de solution digestive IV de collagénase à 0,005 % dans le tube (figure 1H).
note: Préchauffez la solution digestive IV de collagénase à 0,005 % à 37 °C avant la digestion.
- Incuber à 37 °C pendant 15 min. Placez l'aorte digérée et la solution digestive dans une boîte de culture de 100 mm et arrêtez les effets de la collagénase IV à 0,005 % en ajoutant 10 à 15 ml de tampon d'arrêt pré-refroidi : milieu d'arrêt modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de FBS inactivé à la chaleur et 1 % de P/S.
note: Le temps de digestion recommandé est compris entre 10 et 20 minutes. Assurez-vous que la surface endothéliale de l’aorte est recouverte par le tampon d’arrêt.
- Grattez doucement les pAEC de la surface intérieure de l’aorte à l’aide d’un grattoir cellulaire (figure 1I). Lavez l’aorte grattée 3 fois avec un tampon de lavage (5 ml à la fois). Mettre la solution de la boîte de culture dans un tube à centrifuger de 50 ml. Lavez le fond du plat de culture 2 fois avec un tampon de lavage (5 ml à la fois) et mettez à nouveau la solution dans un tube à centrifuger de 50 ml.
note: Grattez doucement dans un sens et ne comprimez pas. Ne touchez pas le tissu près des bords et des trous. Il est recommandé de gratter 5 à 8 fois.
- Centrifuger le tube à 600 x g pendant 6 min à 4 °C. Jeter le surnageant et laisser 10 ml de solution au fond d’un tube à centrifuger de 50 ml. Ajoutez 20 ml de tampon de lavage dans le tube à centrifuger de 50 ml et remettez les granulés en suspension. Évitez les bulles lors de cette étape.
- Centrifuger à 600 x g pendant 6 min à 4 °C. Jeter lentement le surnageant. Remettre les granulés cellulaires en suspension avec 1 mL de milieu de culture et bien mélanger.
note: Le nombre moyen obtenu de CE par cm de l’aorte est de 1,9 x 10⁵ ± 1,4 x 10⁴ (moyenne ± écart-type, n = 3).
- Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Plaquez et cultivez les cellules dans un récipient sans revêtir de matériaux en fonction du numéro de cellule. Si le nombre de cellules est inférieur ou égal à 1,0 x 10⁶, cultiver les cellules dans une fiole de 25 cm². Si le nombre de cellules est supérieur à 1,0 x 10⁶, cultiver les cellules dans plusieurs fioles de 25 cm² (1,0 x 10⁶ cellules par fiole). Placez le ballon dans un incubateur (sans agiter) à 37 °C avec 5 % de CO₂ et remplacez le milieu tous les 2 à 3 jours.
note: Certaines cellules sont endommagées par le grattoir cellulaire. Un test de viabilité cellulaire a révélé que le pourcentage de cellules vivantes était de 95,7 % ± 1,7 % (moyenne ± écart-type, n = 3). Le temps de doublement des cellules isolées est d’environ 1 à 2 jours.
