Vitrification d’embryons de lapin à l’aide de paille cryogénique : une technique de refroidissement ultra-rapide pour préserver les embryons de lapin en vue d’un stockage à long terme

Résumé

Source : Garcia-Dominguez, X. et al. Transfert d’embryons mini-invasif et vitrification embryonnaire au stade optimal de l’embryon dans le modèle de lapin. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure de vitrification des embryons de lapin récoltés au stade de développement souhaité en utilisant de l’éthylène glycol et du diméthylsulfoxyde comme cryoprotecteurs et de la paille cryogénique comme système de transport. Les embryons vitrifiés ont un taux de survie élevé et peuvent être conservés pendant une période prolongée jusqu’à leur utilisation.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Vitrification de l’embryon

1. Effectuez toutes les manipulations à température ambiante (environ 22 °C) pour réduire la toxicité de la solution de vitrification à des températures plus chaudes.
   note: Les embryons peuvent être déplacés à l’aide d’une pipette automatique de 0,1 à 2 μL dans ce protocole, mais d’autres dispositifs similaires pour déplacer les embryons en traînant le volume minimum peuvent convenir.
2. Vitrifier les embryons selon une procédure d’addition en deux étapes :
   1. Placez les embryons pendant 2 minutes dans une solution d’équilibrage composée de 10 % (v/v) d’éthylène glycol et de 10 % (v/v) de diméthylsulfoxyde dissous dans un milieu de base (BM). (Composition de BM : Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) complétée par 0,2 % (p/v) d'albumine sérique bovine)
   2. Placez les embryons (à partir de l’étape 1.2.1) pendant 1 minute dans une solution de vitrification composée de 20 % (v/v) d’éthylène glycol et de 20 % (v/v) de diméthylsulfoxyde dissous dans le BM.
3. Chargez les embryons dans une mini-paille en plastique de 0,25 ml (qui contient une extrémité fermée avec un bouchon en coton et une extrémité ouverte). Le processus est schématisé dans la figure 1.
   1. Couplez l’extrémité fermée de la minipaille de 0,25 mL avec le microdistributeur approprié (par exemple Captroll III®).
   2. Aspirez BM jusqu’à 1/3 de la longueur de la paille, suivi d’une petite bulle d’air.
   3. Aspirez les embryons dans un volume de 40 μL de solution de vitrification, suivi d’une autre petite bulle d’air.
   4. Aspirez le BM jusqu’à ce que la première fraction liquide (étape 1.3.2) atteigne le coton.
   5. Fermez l’extrémité ouverte avec un bouchon de paille.
4. Effectuez l’étape 1.2.2 pendant que l’étape 1.3 est en cours pour vous assurer qu’il ne s’écoule pas plus d’une minute, ce qui serait toxique pour les embryons.
5. Plongez la ministraw directement dans l’azote liquide pour réaliser la vitrification.
6. Stockez la minipaille dans un dewar pour l’azote pendant la durée souhaitée.

Résultats

Figure 1 : Schématisation de la paille correctement chargée. A) La BM fait référence aux milieux manipulateurs d’embryons utilisés lors de la vitrification. Les embryons doivent être chargés dans une solution de vitrification. B) Aspect macroscopique de la paille chargée avec un détail agrandi de la position de l’embryon. Ce dispositif à grand volume nous permet de vitrifier ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine (BSA)	VWR	332
Sulfoxyde de diméthyle	Sigma Aldrich	W387509
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Sans chlorure de calcium.
éthylène glycol	Sigma Aldrich	102466-M
azote liquide	Air Liquide	P1505XXX
Paille en plastique 0,25 mL	IMV - les technologies	Référence 6431
Stéréomicroscope	Leica	MZ16F	Il existe des options moins chères telles que le Leica MZ8 ou le Nikon SMZ-10 ou SMZ-2B, pour n’en nommer que quelques-unes.
Bouchon de paille	IMV - les technologies	Référence 6431