Transfert d’embryons chez le lapin : procédure de transfert guidé par laparoscopie d’embryons dans l’oviducte d’un modèle de lapine receveuse en ovulation

Résumé

Source : Garcia-Dominguez, X. et al., Transfert d’embryons mini-invasif et vitrification embryonnaire au stade optimal de l’embryon dans le modèle de lapin. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo décrit la technique de transfert d’embryons dans l’oviducte d’une lapine receveuse par laparoscopie. Il permet le remodelage embryonnaire chez les lapins pendant sa migration à travers l’oviducte, aidant finalement à une implantation réussie. Cette technique peut également être utilisée pour les embryons stockés avec une bonne efficacité.

Protocole

1. Transfert d’embryons

1. Préparation des femelles receveuses
   1. N’utilisez que des femelles sexuellement matures (> 4,5 mois).
   2. Une semaine avant l’ET, adaptez les femelles à un régime de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité pour initier la croissance folliculaire et améliorer la réceptivité des femelles.
   3. Sélectionnez les femelles receveuses en observant la turgescence et la couleur de la vulve. Si la vulve est turgescente et rougeâtre, la femelle est réceptive.
   4. Induire une pseudo-grossesse (ovulation) par une injection intramusculaire unique de 1 μg d’acétate de buséréline (analogue synthétique de l’hormone de libération des gonadotrophines), quel que soit le poids corporel><. REMARQUE : Normalement, 0,8 μg est une dose appropriée pour l’induction de l’ovulation chez les lapins de taille moyenne (4-5 kg), donc 1 μg garantit généralement l’ovulation.
   5. Induisez l’ovulation autant de jours avant l’âge des embryons à transférer (par exemple, 70-72 h avant la morula fraîche ET).
2. Anesthésie et analgésie
   1. Pesez le lapin et chargez les anesthésiques et analgésiques suivants.
      1. Dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G : chargez de la xylazine (5 mg/kg) et du chlorhydrate de buprénorphine (0,03 mg/kg). Dans une autre seringue de 1 mL avec une aiguille péricrânienne de 23 G, chargez le chlorhydrate de kétamine (35 mg/kg).
   2. Tenez le lapin et injectez le mélange xylazine-buprénorphine par voie intramusculaire.
   3. Insérez l’aiguille péricrânienne avec de la kétamine dans la veine marginale de l’oreille, en introduisant lentement tout le contenu de la seringue par voie intraveineuse.
   4. Fixez l’aiguille et laissez-la insérée tout au long des étapes restantes pour administrer plus d’anesthésie si nécessaire.
   5. Laissez le lapin dans la cage (propre et sans aucun autre animal) sur une scène chaude.
   6. Une fois inconscient, appliquez une pommade oculaire pour éviter la sécheresse de l’œil et vérifiez l’absence de réflexe palpébral.
      note: Ce protocole prévoit une anesthésie chirurgicale d’une durée minimale de 30 min. Si une période plus longue est nécessaire, injecter des doses supplémentaires avec la moitié de la quantité de chlorhydrate de kétamine décrite à 1.2.1 après 30 min.
   7. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de la pédale et le mouvement respiratoire. Les changements dans le schéma respiratoire à un rythme irrégulier et plus rapide indiquent une perte du plan d’anesthésie approprié.
   8. Surveillez la couleur des muqueuses (yeux, lèvres, etc.), la fréquence respiratoire (30-60 respirations par minute), la fréquence cardiaque (120-325 battements par minute) et la température rectale (38-39,6 °C).
   9. Huit heures avant le transfert, retenez la nourriture des animaux pour éviter une plus grande taille et une plus grande activité intestinale jusqu’à ce que le processus ET soit terminé. Laissez libre accès à l’eau.
3. Préparation de l’embryon
   1. Réchauffer le milieu de manipulation embryonnaire à 25 °C : milieu de base (BM), composé de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) complétée par 0,2 % (p/v) d'albumine sérique bovine.
   2. En travaillant au stéréomicroscope, rincer les embryons frais ou décongelés (étape 2) avec BM.
   3. À l’aide de gants stériles, fixez un cathéter péridural 17G correctement configuré à une seringue de 1 ml.
   4. Aspirez 1 cm de BM dans le cathéter, suivi d’une petite bulle d’air.
   5. Aspirez 5 à 7 embryons dans un volume de 10 μL de BM, suivis d’une autre petite bulle d’air.
   6. Terminez le chargement du cathéter en aspirant 1 cm de BM.
4. Transfert d’embryons
   1. Envisagez l’utilisation de gants, d’une blouse et d’un masque stériles pour assurer un environnement aseptique.
   2. Stérilisez les instruments chirurgicaux, nettoyez les surfaces où l’opération sera pratiquée et essuyez-les avec de l’éthanol à 70 %.
   3. Effectuez l’anesthésie comme indiqué précédemment (étape 1.2), en vérifiant la perte de réflexes.
   4. Rasez la fourrure de l’abdomen ventral avec un rasoir électrique.
   5. Préparez l’abdomen ventral de manière aseptique.
      1. Nettoyez la zone chirurgicale et enlevez tous les cheveux restants. Lavez la zone chirurgicale avec un savon au gluconate de chlorhexidine. Désinfectez la zone avec une solution de chlorhexidine et d’éthanol à 96º (3 fois).
   6. Placez l'animal sur une table d'opération chaude, en position de Trendelenburg (tête baissée à 45°) pour vous assurer que l'estomac et les intestins sont situés crâniennement. Envisagez l’évacuation de la vessie si elle est turgescente. Si des viscères sont endommagés au cours du processus, l’animal peut mourir. Il est donc important de bien les localiser (Figure 1).
   7. Couvrez la zone à l’aide d’une serviette stérile, avec un trou (fenestration) exposant la zone rasée, afin de séparer le site chirurgical de toute zone potentiellement contaminante.
   8. Insérez un trocart endoscopique de 5 cm dans la cavité abdominale, de 2 cm caudal à l’apophyse xiphoïde, et insufflez à travers celui-ci la cavité péritonéale à l’aide d’un insufflateur mécanique régulateur de pression.
      note: La pression intra-abdominale doit être de 8 à 12 mmHg avec du CO₂ (Figure 1A).
   9. Insérez la caméra de l’endoscope dans le trocart endoscopique (Figure 1B).
      REMARQUE : Identifiez l’appareil reproducteur, en déterminant l’état et la position de l’infundibulum et de l’ampoule avant l’ET pour faciliter les prochaines étapes.
   10. Insérez l’aiguille péridurale 17-G dans la région inguinale à 2-3 cm de l’infundibulum (figure 1B).
   11. Identifiez l’entrée de l’infundibulum (figures 2A, 2B).
   12. Insérez le cathéter chargé (étape 1.3) dans l’aiguille de la péridurale dans l’abdomen (Figure 1C).
   13. Localisez l’oviducte et insérez 1 à 2 cm du cathéter épidural dans l’infundibulum de l’ampoule (Figure 2A-2C). Ne progressez pas très loin dans l’oviducte pour éviter les dommages et les hémorragies.
   14. Libérez les embryons dans l’oviducte en appuyant doucement sur le piston de la seringue couplée au cathéter (Figure 2D-2F). Les deux bulles d’air doivent sortir du cathéter.
   15. Retirez le cathéter juste après la libération des embryons.
   16. Rincez le cathéter, aspirez et libérez le milieu manipulateur pour vérifier l’absence d’embryons et confirmer leur transfert réussi.
   17. Répétez les étapes 1.4.11 à 1.4.16 de l’autre côté de l’utérus, si vous le souhaitez.
   18. Retirez l’aiguille péridurale et la caméra de l’endoscope.
   19. Libérez le CO₂ par le trocart endoscopique. Si un excès de gaz reste dans l’abdomen de l’animal, il aura de la douleur et de l’inconfort.
   20. Retirez le trocart endoscopique de la cavité abdominale. Retirez la serviette chirurgicale.
   21. Arrêtez l’anesthésie.
   22. Nettoyez l’incision pratiquée par le trocart avec une solution de chlorhexidine. Fermez l’incision pratiquée par le trocart à l’aide d’un pansement en aluminium micronisé et d’un pansement en plastique.

Résultats

Figure 1 : Transfert d’embryons par laparoscopie assisté par laparoscopie (Vue externe).A) Insertion du trocart endoscopique (un orifice). B) Insertion de la caméra endoscopique et de l’aiguille péridurale (flèche noire). C) Insertion du cathéter de transfert d’embryon (flèche blanche) à travers l’aiguille péridurale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine (BSA)	VWR	332
Chlorhydrate de buprénorphine	Alvet Escartí	626	À commander par un vétérinaire agréé.
Acétate de buséréline	Sigma Aldrich	Réf. B3303
Le CO2	Air Liquide	Référence 99921	CO2 N48.
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Sans chlorure de calcium
rasoir	Oster Doré A5	Référence 078005-140-002
Caméra endoscopique	Optomic Spain S.A	OP-714
Trocart endoscopique avec valve feuilletée en silicone	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Référence 30114GK	Modèle de trocart léger.
Savon au digluconate de clorhexidine	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Aiguille Epicraneal 23G	Alvet Escartí	514056353	Des aiguilles plus petites peuvent également être utilisées.
Cathéter péridural	Vygon corporate	187,1
Aiguille péridurale	Vygon corporate	187,1
Pommade oculaire	Alvet Escartí	Référence 5273
Équipement de laparoscopie	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Laparoscope Hopkins®, laparoscope à vision droite de 0º mm, longueur de 30 cm, canal de travail de 5 mm.
source lumineuse	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
Insufflateur mécanique de CO2	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflateur®
Tube en silicone pour insufflato	r Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Stéréomicroscope	Leica	MZ16F	Il existe des options moins chères telles que le Leica MZ8 ou le Nikon SMZ-10 ou SMZ-2B, pour n’en nommer que quelques-unes.
Lapins	Universitat Politècnica de València	Ligne A	D’autres lignées maternelles, telles que la ligne V ou la ligne HP, peuvent être utilisées.