Inactivation d’un gène médié par l’ARN en épingle à cheveux dans les iHSPC in vitro : un système d’expression shRNA basé sur le lentivirus Livraison dans les iHSPC pour l’inactivation de l’expression génique spécifique

Résumé

Source : Hsiao, Y. L., et al. Etude du développement de cellules dendritiques par knockdown de gènes médiés par l’ARN en épingle à cheveux courtes dans une lignée cellulaire de tige hématopoïétique et de progéniteur in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour effectuer la transduction de vecteurs lentiviraux shRNA afin d’obtenir des lignées cellulaires inactivées stables dans des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées (iHSPC).

Protocole

1. Préparation de lignées cellulaires souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées (iHSPCs)

1. Maintenir la lignée cellulaire iHSPC dans un milieu RPMI 1640 complet contenant 100 ng/mL de FL et 1 μM de β-œstradiol.
2. Passage des cellules dans un rapport de 1:10 tous les 3 jours.
   note: Préparez un milieu RPMI 1640 complet en complétant avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 5 ^x10-5 M de β-mercaptoéthanol et 10 μg/mL de gentamicine. Le FL murin recombinant est également disponible dans le commerce.

2. Transduction lentivirale

1. Plaques iHSPC à une densité de 1 x 10⁵ cellules/puits dans des plaques à 12 puits dans 1 mL de milieu complet contenant 100 ng/mL de FL, 1 μM de β-estradiol et 8 μg/mL de polybrene.
   note: La concentration de polybrène dépend des types de cellules et se situe généralement entre 4 et 8 μg/mL.
2. Ajouter le lentivirus porteur de shRNA dans chaque puits à une multiplicité d’infection (MOI) de 100,
   note: Le vecteur lentiviral est pLKO.1-Puro avec un marqueur de sélection de la puromycine (Figure 1). Les séquences cibles des shRNA contre LacZ, Tcf4 et Id2, respectivement, sont répertoriées dans la table des matériaux. Le MOI est défini par le nombre de virions ajoutés par cellule pendant l’infection.
   
3. Faites tourner les plaques à 1 100 x g pendant 90 min à 37 °C.
4. Incuber la plaque contenant les cellules infectées pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur.
   note: Si les cellules sont sensibles au polybrène, rafraîchissez les cellules avec le milieu complet sans polybrène après l’infection par spin.
5. Rafraîchir les cellules avec un milieu complet contenant 100 ng/mL de FL et 1 μM de β-œstradiol 24 h après l’infection.
6. Ajouter 6 μg/mL de puromycine dans le milieu pour sélectionner les cellules infectées après 24 h.
   supplémentaires. note: Le vecteur lentiviral transduit prend généralement 48 h pour exprimer les gènes, y compris le gène résistant à la puromycine. S’assurer que la concentration de puromycine est optimisée pour chaque lignée cellulaire.
7. Actualisez le milieu de sélection contenant 100 ng/mL de FL, 1 μM de β-estradiol et 6 μg/mL de puromycine tous les 3 jours et maintenez les cellules pendant au moins une semaine pour développer les cellules iHSPC transduites de manière stable.
   note: La sélection de la puromycine prend généralement effet 48 h plus tard, et la période de sélection dépend des types de cellules.

Résultats

Figure 1 : La construction du vecteur lentiviral pLKO.1-Puro.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtube de 1,5 mL	ExtraGene	TUBE-170-C
Plaque traitée pour culture tissulaire à 12 puits	Faucon	353043
Sérum fœtal bovin (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 moyen	Gibco	Référence 11875-085
β-œstradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-mercaptoéthanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
Ligand Flt3 (FL)	fait maison
Polybrène	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromycine	Invivogen	ANT-PR-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	Le Consortium ARNi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	Le Consortium ARNi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	Le Consortium ARNi (TRC)