1. Électroporation de lignées de macrophages et de cellules T
- Préparer les cultures cellulaires pour l’électroporation
- Préparez le Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) comme milieu de croissance complet pour les lymphocytes T Jurkat. Préparez le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS pour la culture des macrophages RAW264.7. Compléter tous les milieux de croissance complets avec 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (Pen/Streptocoque), à l’exception des milieux utilisés pour l’incubation post-transfection avant le tri cellulaire.
- Effectuer la sous-culture des cellules T RAW264.7 et Jurkat selon les instructions du fournisseur (voir la table des matériaux). Lors de la sous-culture de cellules RAW264.7, utilisez une solution de trypsine-EDTA (0,25 %) pour détacher les cellules. Utilisez le FBS complété par 10 % (v/v) de DMSO comme milieu de cryoconservation pour les cellules RAW264.7 et Jurkat.
- Prélever des cellules à 250 × g pendant 5 min pour les macrophages RAW264.7 et à 90 × g pendant 8 min pour les lymphocytes T Jurkat. Laver ensuite avec 5 à 10 ml de 1× DPBS (sans ions Ca2+ ou Mg2+). Retirez le DPBS.
- Remettre la pastille en suspension à l’aide de 2 mL de 1× DPBS. Utilisez 10 μL de cellules et mélangez avec un volume égal de bleu de trypan à 0,2 % pour estimer le nombre et la viabilité des cellules.
note: Assurez-vous que la culture cellulaire a une viabilité de >90 % le jour de la transfection.
- Pour une seule expérience de knock-in, effectuez une électroporation avec des pointes de nucléofection de 10 μL avec cinq répétitions. Calculez le volume nécessaire pour des cellules de 2,0 × 106 et granulez les cellules par centrifugation. Lavez à nouveau la pastille cellulaire avec 1× DPBS comme décrit à l’étape 1.1.2.
note: Lors de l’utilisation d’embouts de nucléofection de 10 μL, 4,0 × 105 cellules sont nécessaires par électroporation. En conséquence, préparez au moins 2,0 × 106 cellules pour une expérience d’entraînement.
- Préparez une plaque de 24 puits avec 0,5 mL de milieu de croissance complet (préparé à l’étape 1.1.1) par puits sans Pen/Strep et préchauffez-la dans un incubateur à 37 °C.
2. Électroporation des composants CRISPR/Cas9 et du vecteur de ciblage
- Allumez le système d’électroporation. Utilisez des paramètres d’électroporation optimisés comme suit : 1 400 V/20 ms/2 impulsions pour les macrophages RAW264.7 et 1350 V/20 ms/2 impulsions pour les lymphocytes T Jurkat.
- En tenant compte de la perte d’échantillon due au pipetage, préparer un mélange d’électroporation de 55 μL dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL contenant 2,5 μg de chaque vecteur CRISPR/Cas9 (pDsR-mR26-sg1 et pDsR-mR26-sg2 pour l’incorporation du locus mRosa26, et pDsR-hR26-sg1 et pDsR-hR26-sg2 pour le locus hROSA26), 2,4 μg du vecteur de ciblage linéarisé (pKR26-POI-iBFP ou pKhR26-POI-iBFP pour mRosa26 et hROSA26knock-in, linéarisé par EcoRI ou BamHI), et le tampon de remise en suspension R.
note: Pour gagner du temps, le mélange d’électroporation peut être préparé lors de la centrifugation (étape 1.1.5).
- Mettre en suspension 2,0 × 106 cellules (préparées à l’étape 1.1.5) dans le mélange d’électroporation de 55 μL de l’étape 1.2.2.
- Aspirer le mélange cellule/électroporation à partir de l’étape 1.2.3 à l’aide d’une pointe de nucléofection de 10 μL avec une pipette.
note: Pendant le pipetage, évitez d’introduire des bulles d’air, qui pourraient provoquer une défaillance de l’électroporation.
- Ajouter l’échantillon dans un tube rempli de 3 mL de tampon E du kit d’électroporation.
- Appliquez les paramètres d’électroporation pour les deux types de cellules comme décrit à l’étape 1.2.1.
- Transférez l’échantillon dans un puits de la plaque à 24 puits avec le milieu préchauffé à l’étape 1.1.6.
- Répétez les étapes 1.2.4 à 1.2.7 pour les quatre autres répétitions ainsi que pour le vecteur de ciblage uniquement et le vecteur d’expression CRISPR uniquement controls.
note: Changez l’embout et le tube de nucléofection lorsque vous passez à un autre type de cellule/ADN plasmidique.
- Cultivez les cellules transfectées pendant 48 à 72 h pour permettre la récupération après l’électroporation et l’expression des composants CRISPR/Cas9 avant l’analyse par cytométrie en flux ou le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
