Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparer les cellules souches pour l’édition
- Cultivez et cultivez des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sur une plaque à 6 puits contenant 2,4 × 106 cellules/plaque de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) inactivés à la mitomycine C cultivés sur de la gélatine. Maintenir les hPSC dans 3 ml de milieu de cellules souches embryonnaires humaines par puits (milieu hESC) et cultiver dans un incubateur à 37 °C avec 3 % O2/5 % CO2.
note: Pour le succès de ce protocole, il n’est pas nécessaire de maintenir les hPSC dans un incubateur à faible teneur en oxygène ; cependant, il est important de noter que les hPSC prolifèrent plus rapidement dans un environnement à haute teneur en O2, de sorte que les temps et les numéros de cellules doivent être ajustés en conséquence. Il convient également de noter que les hPSC maintenues dans un faible taux d’oxygène ont des taux de différenciation spontanée plus faibles.
- Pour préparer 500 ml de CSEh, combinez 380 ml de DMEM/F12, 75 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 25 ml de sérum de remplacement KnockOut (KSR). Ajouter de la glutamine (concentration finale de 1 mM), 5 ml d’acides aminés non essentiels 100x, 100 unités/ml de pénicilline-streptomycine (P/S), du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) (concentration finale de 4 ng/ml) et du 2-mercaptoéthanol (concentration finale de 5,5 μM).
- Changez de support en prélevant tout le volume de support (3 ml) à l’aide d’une pipette en verre et sous vide. Remplacer par un milieu hESC chaud de 3 ml à l’aide d’une pipette sérologique. Renouveler le changement de milieu tous les jours jusqu’à ce que les hPSC soient confluents à environ 50 % (jour-1).
- Un jour avant le ciblage (jour-1), changer le milieu hESC, en supprimant l’ancien support et en ajoutant un milieu hESC chaud complété par 10 μM Y-27632.
- Également le jour -1, préparez une à deux plaques de 6 puits ou 10 cm de cellules nourricières MEF résistantes aux médicaments à partir de souris DR4 (2,4 × 106 cellules/plaque).
Remarque : En général, les plaques à 6 puits sont avantageuses par rapport aux plaques de 10 cm, car elles peuvent accueillir plus de fluides. Les plaques à 6 puits garantissent également que les différents clones de différents puits sont indépendants. Cependant, une plaque de 10 cm permettra un prélèvement plus facile, en fonction du microscope disponible pour ce processus.
2. Modification des cellules souches pluripotentes
- Préparez les solutions de transfection en pipetant 5 μg chacun de ZFN 1 et 2 (figure 1) dans un tube de 1,5 ml. Pipetez également 30 μg du plasmide de réparation dans ce tube. Enfin, pipetez 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube pour porter le volume jusqu’à 300 μl.
note: Préparez les plasmides sous forme de midiprep (n’importe quel kit convient) avec une concentration minimale de 300 ng/μl afin de maintenir le volume total de la solution de transfection en dessous de 300 μl. Il n’est pas nécessaire d’effectuer une extraction au phénol/chloroforme, de linéariser le plasmide ou d’utiliser un kit de préparation de plasmide sans endotoxines.
- Retirez le support des CSPh à l’aide d’une pipette en verre et passez sous vide. Pipette 2 ml tiède 1x PBS dans chaque puits pour laver les cellules.
- Retirez immédiatement le PBS à l’aide d’une pipette en verre et passez sous vide. Ajouter 0,5 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % directement sur les cellules de chaque puits. Placer dans l’incubateur (37 °C/5 % CO2/3 % O2) pendant environ 10 minutes ou jusqu’à ce que la couche nourricière commence à se détacher de la plaque.
- Ajouter 2 ml de milieu esWash chaud (470 ml de DMEM/F12, 25 ml de FBS, 100 unités/ml P/S) dans chaque puits pour arrêter la réaction de la trypsine.
- Assurez-vous que les cellules d’alimentation se détachent comme une feuille. Pipeter le contenu de chaque puits dans un seul tube conique de 50 ml, en combinant tous les puits. Triturez les cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Il n’est pas nécessaire de briser la couche d’alimentation ; Les hPSC se détachent de la couche nourricière par trituration douce. Il doit y avoir environ 15 ml de suspension cellulaire.
- Ajoutez 25 ml de média esWash dans le tube pour porter le volume jusqu’à 40 ml au total. Laissez les gros morceaux de la mangeoire se déposer au fond du tube pendant 1 à 2 min. Retirer le surnageant (~38 ml) du tube à l’aide d’une pipette sérologique et le déposer dans un nouveau tube conique de 50 ml.
- Essorer pendant 5 min à 190 x g. Retirer le surnageant du tube à l’aide d’une pipette en verre et mettre sous vide. Assurez-vous de ne pas déranger la pastille de cellule. Remettre les cellules en suspension dans 500 μl 1x PBS. Combiner avec une solution de transfection plasmidique préparée précédemment. Comptez les cellules à cette étape. Utilisez 5 à 10 millions de cellules par électroporation.
- Pipetez toute la suspension de 800 μl dans une cuvette d’électroporation de 4 mm, placez-la sur de la glace pendant 3 à 5 min. Électroporez les cellules en utilisant le programme exponentiel sur le système d’électroporation avec les paramètres suivants : 250 V, 500 μF, résistance ∞ et taille de cuvette de 4 mm. Après électroporation, remettre la cuvette sur la glace pendant 3 min
note: Observez la constante de temps de l’électroporation sur le système d’électroporation. La constante de temps varie en fonction du nombre de cellules et de la pureté de l’ADN. Les transfections réussies ont généralement une constante de temps comprise entre 10 et 14 ms lorsqu’elles sont utilisées dans les conditions énumérées et un pulseur de gène II. Des rendements d’électroporation plus faibles peuvent se produire lorsque les constantes de temps s’écartent de ces valeurs.
- Mettre en suspension les cellules électroporées dans 18 ml de milieu hESC chaud complété par 10 μM Y-27632. Plaquez 3 ml de cette suspension unicellulaire dans chaque puits d’une plaque à 6 puits avec des cellules d’alimentation DR4. Retourner à l’incubateur (37 °C/5 % CO2/3 % O2).
3. Sélection des colonies positives
- Jour 2, retirez tous les supports à l’aide d’une pipette en verre et passez l’aspirateur. Remplacer par 3 ml de milieu hESC chaud complété par 10 μM Y-27632. Jour 3, retirez tous les supports à l’aide d’une pipette en verre et passez l’aspirateur. Remplacer par 3 ml de support hESC chaud sans inclure le Y-27632. Jour 4, retirez tous les supports à l’aide d’une pipette en verre et passez l’aspirateur. Remplacer par 3 ml de milieu hESC chaud complété par des antibiotiques pour la sélection. Retour à l’incubateur (37 °C/5 % CO2/3 % O2).
note: Le type d’antibiotique utilisé dépendra de la cassette de résistance incluse dans le modèle de réparation. En travaillant avec des hPSC WIBR#3 (registre NIH 0079), 0,5 μg/ml de puromycine, 70 μg/ml de G418 (génétique) et 35 μg/ml d’hygromycine ont été utilisés avec succès. Les concentrations pour la sélection doivent être déterminées empiriquement en établissant la concentration minimale d’antibiotique nécessaire pour tuer les cellules de type sauvage dans un délai d’environ une semaine.
- Jours 5 à 12, changer de milieu tous les jours, en remplaçant chaque fois l’ancien milieu par des milieux chauds avec des cellules souches embryonnaires.
note: Attendez-vous à une grande quantité de mort cellulaire. Les colonies individuelles deviendront apparentes vers le jour 8 à 10. Des milieux CSEh réguliers sans antibiotiques peuvent être utilisés après 12 à 14 jours de sélection continue. Si la densité cellulaire est élevée ou si la mort cellulaire est lente, l’acidification du milieu doit être évitée et il peut être nécessaire d’augmenter le volume du milieu (jusqu’à 4-5 ml) au cours des premiers jours de sélection.
