Intégration génique ciblée médiée par TALEN : utilisation de nucléases spécifiques à une séquence modifiée pour l’insertion précise d’un gène de protéine fluorescente dans des hiPSC

Abstract

Source : Cerbini, T. et al. Transfection, sélection et sélection de colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines ciblées par TALEN avec un gène GFP dans la sphère de sécurité AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo décrit une technique précise d’édition du génome dans des cellules souches pluripotentes induites humaines, ou hiPSC, à l’aide de TALEN pour créer des cassures double brin au niveau d’un locus ciblé, induisant une réparation dirigée par homologie pour l’intégration des gènes de la protéine de fluorescence.

Protocol

1. Préparation de la matrice de membrane basale et revêtement de la vaisselle en plastique

1. Placez le stock de matrice de membrane basale congelé à -20 °C sur de la glace et décongelez toute la nuit à 4 °C.
2. Après décongélation, pipeter des aliquotes de 2 mg de matrice de membrane basale dans des tubes Eppendorf pré-refroidis. Conservez-les à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
3. Pour préparer des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale, décongelez une aliquote sur de la glace jusqu’à ce que le dernier morceau de glace dans le tube d’Eppendorf disparaisse (généralement dans un délai de ~2 heures).
4. Après la décongélation, ajouter la matrice de membrane basale à 12 ml de DMEM/F12 froid (4 °C) pour obtenir une solution de revêtement de matrice de membrane basale.
5. Ajouter la solution de matrice de membrane basale dans le récipient de culture approprié. Pour une plaque à 6 puits, distribuer 1 ml par puits. Faites tourner la plaque pour vous assurer que la solution de matrice de membrane basale recouvre complètement chaque puits.
6. Parafilm sceller la membrane basale de la plaque / le plat revêtu de matrice et incuber à température ambiante pendant 1 heure avant utilisation. Vous pouvez également stocker les plaques/plats recouverts d’une matrice de membrane basale à 4 °C et les utiliser dans les 2 semaines suivant le revêtement.
   note: Ajoutez du DMEM/F12 supplémentaire à la plaque ou à la boîte recouverte d’une matrice de membrane basale pour éviter le dessèchement. Avant d’utiliser une plaque ou un plat à membrane sous-sol stocké à 4 °C, placez-le dans une enceinte de sécurité biologique et laissez-le revenir à température ambiante pendant au moins 30 min.
7. Aspirer complètement la matrice de la membrane basale avant l’ajout du milieu et des cellules.

2. Préparation du milieu E8

1. Préparez le milieu de culture E8 en décongelant le supplément E8 pendant la nuit à 4 °C.
2. Retirer 10 ml de milieu basal E8 du bouillon de 500 ml et jeter.
3. Pipetez l’intégralité du flacon de 10 ml de supplément E8 directement dans 490 ml de milieu de base E8. Ne réchauffez pas le milieu E8 complet dans un bain d’eau à 37 °C, car les fluctuations de température répétées peuvent dégrader le bFGF dans le milieu E8 complet.
4. Utilisez le milieu E8 complet dans les 2 semaines suivant l’ajout du supplément.

3. Décongélation des iPSC

1. Retirez un flacon d’iPSC congelés de l’azote liquide et placez-le sur de la glace sèche.
2. Décongelez rapidement le flacon dans un bain-marie à 37 °C ; faites-le tourner dans le bain-marie jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un minuscule fragment de glace.
3. Vaporisez le flacon avec de l’éthanol à 70 % et transférez-le dans une enceinte de sécurité biologique.
4. Ajouter 1 ml de E8 medium à température ambiante directement dans le flacon.
5. À l’aide d’une pipette de 2 ml, transvaser la suspension cellulaire goutte à goutte dans 9 ml de milieu E8 dans un tube conique de 15 ml. Faites tourner le tube fréquemment pour vous assurer que les cellules et le milieu se mélangent bien et rapidement.
6. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de E8 complété par 10 μM d’Y-27632.
8. Ajoutez les cellules à un nombre approprié de puits recouverts d’une matrice de membrane basale et placez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit. Il est recommandé de plaquer au moins 0,2 x 10⁶ iPSC par puits d’une plaque à 6 puits pour permettre une récupération rapide après décongélation.

4. Maintenance et passage régulier des iPSC

1. Rafraîchir E8 moyen tous les jours.
2. Surveillez la morphologie et la confluence des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Les iPSC de haute qualité se développent en colonies plates avec des bords distincts ; les colonies individuelles ont un aspect de « pavé ».
3. Passage des cellules iPSC lorsqu’elles atteignent ~70 % de confluence.
4. Préparez une solution de passage d’EDTA en ajoutant 0,9 g de NaCl et 500 μl d’EDTA 0,5 M à 500 ml de DPBS. Bien mélanger pour dissoudre le NaCl et filtrer sous vide pour stériliser. Réchauffez une partie aliquote de la solution de passage dans un bain-marie à 37 °C avant le passage.
5. Pour le passage, aspirez le milieu de culture épuisé et lavez une fois les cellules avec un volume égal de solution de passage chaude. Aspirez et pipetez suffisamment de solution de passage d’EDTA pour enrober les cellules (1 ml par puits d’une plaque à 6 puits).
6. Placez les cellules sous un microscope inversé et observez les colonies d’iPSC. L’apparition de trous dans les colonies et de bordures surélevées devrait apparaître dans les 2 à 5 minutes.
7. Aspirez soigneusement la solution de passage EDTA.
8. À l’aide d’une pipette de 10 ml, versez 4 ml de milieu E8 (si vous utilisez une plaque à 6 puits) sous haute pression directement dans chaque puits à passer.
9. Recueillir les amas d’iPSC et les diviser en un nombre approprié de puits en fonction du rapport de division de 1:8 à 1:12. Ne pas trop pipeter, car la désagrégation des amas de cellules entraînera une faible viabilité.
10. Placez la plaque dans un incubateur et balancez-la d’avant en arrière et d’un côté à l’autre plusieurs fois pour disperser les cellules.

5. Préparation des MEF et des iPSC pour la transfection

1. 48 heures avant la transfection, passage des iPSC à ~1:6 dans quatre puits ou plus d’une plaque à 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale, de sorte qu’ils seront confluents à 70 % deux jours plus tard.
2. Le lendemain, décongelez les MEF DR4 dans un milieu MEF composé de DMEM (high glucose) complété par 10 % de FBS et 1x MEM-NEAA.
3. Disposez les MEF DR4 dans deux plats de 10 cm à ~ 2 x 10⁴ cellules/cm² et incubez toute la nuit à 37 °C.
4. Le jour de la transfection, changer le milieu MEF en E8 complété par 10 μM Y-27632 30 min avant d’effectuer la transfection sur les iPSC.
5. Facultatif : 4 heures avant la transfection, compléter la culture d’iPSC avant la transfection avec de l’Y-27632 à la concentration finale de 10 μM.

6. Traitement par réactif de dissociation cellulaire douce et transfection d’iPSC à l’aide d’un système d’électroporation

1. Retirer la solution de transfection de cellules primaires P3 à 4 °C et la laisser revenir à température ambiante pendant ~30 min. Ajouter l’intégralité du supplément de 100 μl à la solution de transfection avant utilisation.
2. Réactif chaud de dissociation cellulaire douce dans un bain-marie à 37 °C.
3. Obtenir des TALEN AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 et pZT-AAVS1-R1) et des donneurs AAVS1-CAG-EGFP à partir de -20 °C.
4. Retirez les iPSC de l’incubateur et lavez-les une fois avec du DPBS.
5. Ajouter 1 ml de réactif de dissociation cellulaire douce par puits et incuber les iPSC à 37 °C pendant 5 min, ou jusqu’à ce que plus de 50 % des cellules se soient dissociées du récipient de culture.
6. Pipetez les cellules de haut en bas à l’aide d’une pipette p1000 pour dissocier les cellules restantes du récipient de culture et pour briser les amas d’iPSC.
7. Ajoutez 2 ml de milieu E8 dans chaque puits et pipetez de haut en bas plusieurs fois à l’aide d’une pipette de 10 ml pour désagréger davantage les amas de cellules en cellules individuelles.
   note: L’efficacité de la transfection diminue considérablement si les amas de cellules ne sont pas suffisamment désagrégés.
8. Prélever les iPSC dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 100 x g pendant 3 min.
9. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une quantité minimale de milieu E8.
10. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre après l’application d’un colorant vital tel que 0,4 % de bleu de trypan. Assurez-vous que les cellules sont suffisamment dissociées pendant le comptage (1 à 3 cellules par « amas »).
11. Versez 3 cellules de 10⁶ dans chacun des deux tubes coniques de 15 ml et tournez à nouveau à 100 x g pendant 3 min
    note: La centrifugation à basse vitesse réduit la contrainte de la cellule et permet une remise en suspension facile des iPSC avant l’électroporation.
12. Réglez le système d’électroporation sur le programme spécifique au type de cellule pour la lignée de cellules souches embryonnaires humaines H9 (programme CB-150).
13. Après la centrifugation, aspirez le surnageant des pastilles cellulaires. À une pastille, ajouter 10 μg du donneur HR comme échantillon témoin. À l’autre pastille, ajoutez 10 μg du donneur HR, ainsi que 5 μg de chaque TALEN (pZT-AAVS1-L1 et pZT-AAVS1-R1) comme échantillon expérimental.
14. Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 100 μl de solution de transfection de cellules primaires P3 et transférer dans une cuvette.
15. Effectuez la transfection et ajoutez immédiatement 500 μl de fluide E8 à température ambiante dans chaque cuvette.
16. Transférez les iPSC transfectées goutte à goutte dans une boîte de 10 cm contenant des MEF DR4 préparée à l’étape 5.4.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Matrice à membrane basale à facteur de croissance réduit (DFG), *sans LDEV, 10 ml	Corning	Référence 354230	Conserver à -20 °C.
DMEM/F-12	Technologies de la vie	Référence 11320-033	Conserver à 4 °C.
Costar 6 Well Clear Plaques à puits multiples traitées TC	Corning	Référence 3506
Essentiel 8 Moyen	Technologies de la vie	A1517001	Conserver le milieu de base à 4 °C. Conserver le supplément à -20 °C.
Chlorhydrate de dichlorhydrate Y-27632	Tocris	1254	Conserver à température ambiante. Une fois dissous dans H2O, conserver à -20 °C.
chlorure de sodium	sigma	Réf. S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Technologies de la vie	Référence 15575-020
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Technologies de la vie	Référence 14190-250
Boîte de culture traitée TC de 100 mm	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Académique	GlobalStem	GSC-6204G	Conserver dans de l’azote liquide.
DMEM, glycémie élevée, pyruvate	Technologies de la vie	Référence 11995-040	Conserver à 4 °C.
Sérum fœtal bovin défini, origine américaine	HyClone	SH30070.03	Conserver à -20 °C. Décongeler à 4 °C pendant la nuit et aliquoter. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100X)	Technologies de la vie	Référence 11140-050	Conserver à 4 °C.
Unité centrale 4D-Nucleofector	Lonza	AAF-1001B	Partie du système d’électroporation.
Unité 4D-Nucleofector X	Lonza	AAF-1001X	Partie du système d’électroporation.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 ECR)	Lonza	V4XP-3024	À l’arrivée, prélever la solution de cellules primaires et la compléter et la conserver à 4 °C.
StemPro Accutase réactif de dissociation cellulaire	Technologies de la vie	A1110501	Conserver à -20 °C. Décongeler une nuit à 4 °C et réchauffer une aliquote au bain-marie à 37 °C avant utilisation.
Milieu de culture NutriStem XF/FF	Tige	01-2005	Conserver à -20 °C. Décongeler une nuit à 4 °C
TALEN AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 et pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 et 52638
AAVS1-CAG-EGFP Donneur de recombinaison homologue	Addgene	Référence 22212
Chlorhydrate de puromycine	Technologies de la vie	Référence A11138-03	Conserver à -20 °C. Préparer des aliquotes de travail de 1 mg/ml en jj2O.
Pipettes jetables en verre borosilicaté Pasteur	Fisher Scientific	Référence 13-678-20A
Sorvall Legend XTR (réfrigéré), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	Tél. : 75-004-521
TX-750 Rotor à godet oscillant 4 × 750 ml	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Technologies de la vie	Référence 15250-061