1. Préparation de la matrice de membrane basale et revêtement de la vaisselle en plastique
- Placez le stock de matrice de membrane basale congelé à -20 °C sur de la glace et décongelez toute la nuit à 4 °C.
- Après décongélation, pipeter des aliquotes de 2 mg de matrice de membrane basale dans des tubes Eppendorf pré-refroidis. Conservez-les à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Pour préparer des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale, décongelez une aliquote sur de la glace jusqu’à ce que le dernier morceau de glace dans le tube d’Eppendorf disparaisse (généralement dans un délai de ~2 heures).
- Après la décongélation, ajouter la matrice de membrane basale à 12 ml de DMEM/F12 froid (4 °C) pour obtenir une solution de revêtement de matrice de membrane basale.
- Ajouter la solution de matrice de membrane basale dans le récipient de culture approprié. Pour une plaque à 6 puits, distribuer 1 ml par puits. Faites tourner la plaque pour vous assurer que la solution de matrice de membrane basale recouvre complètement chaque puits.
- Parafilm sceller la membrane basale de la plaque / le plat revêtu de matrice et incuber à température ambiante pendant 1 heure avant utilisation. Vous pouvez également stocker les plaques/plats recouverts d’une matrice de membrane basale à 4 °C et les utiliser dans les 2 semaines suivant le revêtement.
note: Ajoutez du DMEM/F12 supplémentaire à la plaque ou à la boîte recouverte d’une matrice de membrane basale pour éviter le dessèchement. Avant d’utiliser une plaque ou un plat à membrane sous-sol stocké à 4 °C, placez-le dans une enceinte de sécurité biologique et laissez-le revenir à température ambiante pendant au moins 30 min.
- Aspirer complètement la matrice de la membrane basale avant l’ajout du milieu et des cellules.
2. Préparation du milieu E8
- Préparez le milieu de culture E8 en décongelant le supplément E8 pendant la nuit à 4 °C.
- Retirer 10 ml de milieu basal E8 du bouillon de 500 ml et jeter.
- Pipetez l’intégralité du flacon de 10 ml de supplément E8 directement dans 490 ml de milieu de base E8. Ne réchauffez pas le milieu E8 complet dans un bain d’eau à 37 °C, car les fluctuations de température répétées peuvent dégrader le bFGF dans le milieu E8 complet.
- Utilisez le milieu E8 complet dans les 2 semaines suivant l’ajout du supplément.
3. Décongélation des iPSC
- Retirez un flacon d’iPSC congelés de l’azote liquide et placez-le sur de la glace sèche.
- Décongelez rapidement le flacon dans un bain-marie à 37 °C ; faites-le tourner dans le bain-marie jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un minuscule fragment de glace.
- Vaporisez le flacon avec de l’éthanol à 70 % et transférez-le dans une enceinte de sécurité biologique.
- Ajouter 1 ml de E8 medium à température ambiante directement dans le flacon.
- À l’aide d’une pipette de 2 ml, transvaser la suspension cellulaire goutte à goutte dans 9 ml de milieu E8 dans un tube conique de 15 ml. Faites tourner le tube fréquemment pour vous assurer que les cellules et le milieu se mélangent bien et rapidement.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de E8 complété par 10 μM d’Y-27632.
- Ajoutez les cellules à un nombre approprié de puits recouverts d’une matrice de membrane basale et placez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit. Il est recommandé de plaquer au moins 0,2 x 10⁶ iPSC par puits d’une plaque à 6 puits pour permettre une récupération rapide après décongélation.
4. Maintenance et passage régulier des iPSC
- Rafraîchir E8 moyen tous les jours.
- Surveillez la morphologie et la confluence des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Les iPSC de haute qualité se développent en colonies plates avec des bords distincts ; les colonies individuelles ont un aspect de « pavé ».
- Passage des cellules iPSC lorsqu’elles atteignent ~70 % de confluence.
- Préparez une solution de passage d’EDTA en ajoutant 0,9 g de NaCl et 500 μl d’EDTA 0,5 M à 500 ml de DPBS. Bien mélanger pour dissoudre le NaCl et filtrer sous vide pour stériliser. Réchauffez une partie aliquote de la solution de passage dans un bain-marie à 37 °C avant le passage.
- Pour le passage, aspirez le milieu de culture épuisé et lavez une fois les cellules avec un volume égal de solution de passage chaude. Aspirez et pipetez suffisamment de solution de passage d’EDTA pour enrober les cellules (1 ml par puits d’une plaque à 6 puits).
- Placez les cellules sous un microscope inversé et observez les colonies d’iPSC. L’apparition de trous dans les colonies et de bordures surélevées devrait apparaître dans les 2 à 5 minutes.
- Aspirez soigneusement la solution de passage EDTA.
- À l’aide d’une pipette de 10 ml, versez 4 ml de milieu E8 (si vous utilisez une plaque à 6 puits) sous haute pression directement dans chaque puits à passer.
- Recueillir les amas d’iPSC et les diviser en un nombre approprié de puits en fonction du rapport de division de 1:8 à 1:12. Ne pas trop pipeter, car la désagrégation des amas de cellules entraînera une faible viabilité.
- Placez la plaque dans un incubateur et balancez-la d’avant en arrière et d’un côté à l’autre plusieurs fois pour disperser les cellules.
5. Préparation des MEF et des iPSC pour la transfection
- 48 heures avant la transfection, passage des iPSC à ~1:6 dans quatre puits ou plus d’une plaque à 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale, de sorte qu’ils seront confluents à 70 % deux jours plus tard.
- Le lendemain, décongelez les MEF DR4 dans un milieu MEF composé de DMEM (high glucose) complété par 10 % de FBS et 1x MEM-NEAA.
- Disposez les MEF DR4 dans deux plats de 10 cm à ~ 2 x 10⁴ cellules/cm² et incubez toute la nuit à 37 °C.
- Le jour de la transfection, changer le milieu MEF en E8 complété par 10 μM Y-27632 30 min avant d’effectuer la transfection sur les iPSC.
- Facultatif : 4 heures avant la transfection, compléter la culture d’iPSC avant la transfection avec de l’Y-27632 à la concentration finale de 10 μM.
6. Traitement par réactif de dissociation cellulaire douce et transfection d’iPSC à l’aide d’un système d’électroporation
- Retirer la solution de transfection de cellules primaires P3 à 4 °C et la laisser revenir à température ambiante pendant ~30 min. Ajouter l’intégralité du supplément de 100 μl à la solution de transfection avant utilisation.
- Réactif chaud de dissociation cellulaire douce dans un bain-marie à 37 °C.
- Obtenir des TALEN AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 et pZT-AAVS1-R1) et des donneurs AAVS1-CAG-EGFP à partir de -20 °C.
- Retirez les iPSC de l’incubateur et lavez-les une fois avec du DPBS.
- Ajouter 1 ml de réactif de dissociation cellulaire douce par puits et incuber les iPSC à 37 °C pendant 5 min, ou jusqu’à ce que plus de 50 % des cellules se soient dissociées du récipient de culture.
- Pipetez les cellules de haut en bas à l’aide d’une pipette p1000 pour dissocier les cellules restantes du récipient de culture et pour briser les amas d’iPSC.
- Ajoutez 2 ml de milieu E8 dans chaque puits et pipetez de haut en bas plusieurs fois à l’aide d’une pipette de 10 ml pour désagréger davantage les amas de cellules en cellules individuelles.
note: L’efficacité de la transfection diminue considérablement si les amas de cellules ne sont pas suffisamment désagrégés.
- Prélever les iPSC dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 100 x g pendant 3 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une quantité minimale de milieu E8.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre après l’application d’un colorant vital tel que 0,4 % de bleu de trypan. Assurez-vous que les cellules sont suffisamment dissociées pendant le comptage (1 à 3 cellules par « amas »).
- Versez 3 cellules de 10⁶ dans chacun des deux tubes coniques de 15 ml et tournez à nouveau à 100 x g pendant 3 min
note: La centrifugation à basse vitesse réduit la contrainte de la cellule et permet une remise en suspension facile des iPSC avant l’électroporation.
- Réglez le système d’électroporation sur le programme spécifique au type de cellule pour la lignée de cellules souches embryonnaires humaines H9 (programme CB-150).
- Après la centrifugation, aspirez le surnageant des pastilles cellulaires. À une pastille, ajouter 10 μg du donneur HR comme échantillon témoin. À l’autre pastille, ajoutez 10 μg du donneur HR, ainsi que 5 μg de chaque TALEN (pZT-AAVS1-L1 et pZT-AAVS1-R1) comme échantillon expérimental.
- Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 100 μl de solution de transfection de cellules primaires P3 et transférer dans une cuvette.
- Effectuez la transfection et ajoutez immédiatement 500 μl de fluide E8 à température ambiante dans chaque cuvette.
- Transférez les iPSC transfectées goutte à goutte dans une boîte de 10 cm contenant des MEF DR4 préparée à l’étape 5.4.
