Intégration de transgènes dirigée par phiC31-Integrase : une technique de micro-injection pour l’intégration de transgènes spécifiques à un site dans un vecteur d’anophèles

1. Préparation des plasmides pour le mélange de micro-injection

REMARQUE : Le protocole illustré ici implique l’utilisation de deux plasmides : un plasmide donneur marqué attB (site d’attachement dérivé de la bactérie hôte) portant le transgène d’intérêt, et un plasmide auxiliaire qui exprime l’intégrase φC31 sous la régulation du promoteur Hsp70 de la drosophile.

1. Purifiez les plasmides du donneur et de l’aide à l’aide d’un kit de purification de plasmides sans endotoxines.
   note: Séquencez la préparation finale du plasmide utilisée pour l’injection afin de vérifier l’intégrité de tous les composants.
2. Combiner des quantités appropriées des deux plasmides pour obtenir un mélange avec une concentration finale de 350 ng/μL du plasmide donneur et de 150 ng/μL du plasmide auxiliaire lorsqu’il est remis en suspension dans le tampon d’injection.
   note: Lors du calcul du volume de mélange nécessaire, il faut tenir compte du fait que 10 à 15 μL sont suffisants pour chaque jour d’injections prévues et que l’ADN peut être préparé à l’avance et stocké à -20 °C. Des concentrations de plasmide auxiliaire d’intégrase de 60 à 500 ng/μL et des concentrations de plasmide de donneur de 85 à 200 ng/μL ont également été signalées.
3. Précipitez l’ADN en ajoutant 0,1 volume d’acétate de sodium 3M (pH 5,2) et 2,5 volumes d’EtOH 100 % glacé et de vortex. Un précipité blanc doit être immédiatement visible. Le fait d’avoir des préparations plasmidiques initiales hautement concentrées (c’est-à-dire ~1 μg/μL) améliore l’efficacité de la précipitation.
   note: Point d’arrêt - Le précipité peut être stocké à -20 °C pendant la nuit.
4. Centrifugez à 15 000 x g pendant 20 min à 4 °C, jetez le surnageant et lavez la pastille avec 1 ml d’EtOH glacé à 70 %.
5. Lavez la pastille avec 1 ml d’EtOH 70 % glacé et centrifugez-la à 15 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
6. Jetez le surnageant sans déranger la pastille et séchez-le à l’air.
7. Remettre la pastille en suspension dans 1x tampon d’injection (0,1 mM Na₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm filtre stérilisé) pour atteindre une concentration finale totale de 500 ng/μL.
   note: Supposons qu’une partie de l’ADN sera perdue pendant le processus de précipitation ; par conséquent, ajoutez d’abord un plus petit volume de tampon d’injection, vérifiez la concentration sur un spectrophotomètre (par exemple, Nanodrop), puis ajoutez un volume restant approprié pour atteindre 500 ng/μL.
8. Assurez-vous que l’ADN est complètement remis en suspension, préparez des aliquotes de 10 à 15 μL chacune et conservez-les à -20 °C.
9. Le jour de l’injection, décongeler une aliquote et centrifuger à 15 000 x g pendant 5 min pour éliminer tout résidu particulaire.
   REMARQUE : Une autre méthode d’élimination des particules consiste à filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm. Évitez la présence de résidus de particules dans le mélange d’injection, car ils entraînent le blocage de l’aiguille lors de la microinjection d’embryons.

2. Micro-injection d’embryons à partir d’une ligne d’amarrage d’anophèles

1. Administrer par le sang les moustiques âgés de 4 à 7 jours à partir de la ligne d’amarrage souhaitée 72 h avant la micro-injection (c.-à-d. pour l’injection le lundi et le mardi, nourrir les femelles le vendredi précédent ; pour l’injection le jeudi et le vendredi, nourrir les femelles le lundi de la même semaine).
2. Nourrissez par le sang des moustiques de type sauvage (c’est-à-dire des moustiques ayant le même fond génomique que la ligne d’amarrage) le même jour ; ceux-ci seront nécessaires pour l’allopollinisation.
   note: La taille et la qualité du repas de sang affectent la qualité des œufs, il est donc recommandé de toujours utiliser du sang frais (c’est-à-dire du sang prélevé dans les 7 jours précédents). L’alimentation par bras ou sur des souris peut augmenter la qualité et la quantité d’œufs, mais ces méthodes ne sont pas encouragées. Des protocoles spécifiques approuvés seront nécessaires pour l’utilisation humaine et animale.
3. Effectuer des micro-injections d’embryons
   1. Effectuez des micro-injections d’embryons d’An. gambiae dans 25 mM de NaCl en ciblant le pôle postérieur de l’embryon à un angle de 45 degrés. Pour un protocole détaillé pour la collecte, l’alignement et la micro-injection d’embryons, voir Pondeville et al.et Lobo et al.
   2. Effectuez des micro-injections d’embryons d’An. stephensi dans de l’huile d’halocarbure 700:27 (2:1) en ciblant le pôle postérieur de l’embryon à un angle de 30 degrés. Un protocole détaillé pour la collecte, l’alignement et la micro-injection d’embryons peut être trouvé dans Terenius et al.et Lobo et al.
   3. Transférez les œufs immédiatement après l’injection dans une boîte de Pétri remplie d’eau distillée stérile (pH 7,2) et remettez-les dans des conditions insectivores.
4. À l’éclosion, transférez quotidiennement les larves G₀ dans un plateau avec de l’eau distillée salée (0,1 % de sel tonique) et faites-les revenir aux nymphes.
5. Enregistrer le taux d’éclosion (c.-à-d. le nombre de larves éclores/le nombre d’embryons injectés).
   note: Le mouvement de l’embryon facilite l’éclosion, il est donc souhaitable qu’un léger tourbillon soit souhaitable. L’éclosion doit commencer ~48 h après l’injection. Étant donné que l’injection peut entraîner un léger retard de développement, il est conseillé de continuer à surveiller les larves à éclosion tardive pendant 3 à 4 jours.