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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Définition du protospacer et construction du plasmide
REMARQUE : Dans cette section, la première étape de sélection des protoespaceurs appropriés pour la construction de l’ARNsg et la ligature ultérieure dans pMaOri.dCas9, est décrite (Figure 1). Cette séquence protospacer comprend une séquence de 20 nucléotides contre la cible souhaitée.
- Obtenir la séquence nucléotidique du gène d’intérêt pour le silençage à GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Soumettez-le au serveur web CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), avec les paramètres définis pour Streptococcus pyogenes Cas9 et le motif adjacent protospacer NGG après avoir sélectionné la « Cible Fasta ». Définissez les paramètres sur « CRISPR/Cas9 » et PAM (protospacer adjacent motif) NGG.
- Sur la base des résultats obtenus, sélectionnez des protospacers avec le meilleur score possible (flèche verte), qui sont situés aussi près que possible de l’extrémité 5' de la région codante et, surtout, qui sont contenus dans le brin modèle (moins) puisque l’ARNsg doit s’apparier au brin codant du gène pour un silençage génique complet.
note: Le motif NGG n’est pas inclus dans la séquence finale de l’ARNsg.
- Utilisez le promoteur lipL32 pour exprimer l'ARN guide unique qui contient une séquence variable de 20 nucléotides à l'extrémité 5' et une séquence d'échafaudage dCas9 conservée. Fusionner la séquence de 20 nt, appelée protospacer, avec le promoteur lipL32 (à son extrémité 5') et l'échafaudage de l'ARNsg (3'end) (Figure 1B).
note: Pour un promoteur lipL32 bien défini, utilisez la région promotrice comprenant -334 au TSS (Transcription Start Site, basé sur Zhukova et al.). Consultez le tableau 1 pour la cassette finale d’ARNsg.
- Générez la cassette d’ARNsg par PCR séquentielle ou faites-la synthétiser par un fournisseur commercial.
- Après avoir obtenu la cassette, ligaturez-la dans le plasmide pMaOri.dCas9 au site de restriction XmaI aux deux extrémités (cccggg).
- Digérer à la fois la cassette d’ARNsg et le plasmide pMaOri.dCas9 avec l’enzyme de restriction XmaI et procéder à la ligature (Figure 1B).
- Effectuer les étapes de clonage dans la souche auxotrophe dT E. coli π1, due à l’origine de réplication pMaOri (et par extension, pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
REMARQUE : Pour un protocole détaillé pour la ligature et la sélection des clones, reportez-vous aux publications précédentes de Fernandes et Nascimento. Le dCas9 guidé par l’ARNsg se liera au brin codant du gène d’intérêt sélectionné et, par conséquent, obstruera l’élongation de l’ARN polymérase (Figure 1C), entraînant le silençage génique.
2. Transformation de Leptospira par conjugaison
REMARQUE : Un schéma graphique de cette étape est présenté à la figure 2. Pour fabriquer des supports HAN et des plaques HAN, reportez-vous à Hornsby et al. et Fernandes et al.
- Cultiver des cellules pathogènes de Leptospira à 29 ou 37 °C dans un milieu HAN sous agitation en diluant une culture saturée dans du HAN frais à 1:100 ; généralement, la souche sérovare de Copenhageni Fiocruz L1-130 de L. interrogans prend 4 à 6 jours pour atteindre la densité cellulaire appropriée.
- S’assurer que les cultures atteignent un diamètre extérieur de 0,2 à 0,4 à 420 nm (2 à 5 x 108 cellules/mL) avant de les utiliser pour la conjugaison.
note: Étant donné que le milieu HAN change de couleur à mesure que les densités cellulaires augmentent (en raison du rouge de phénol contenu dans le milieu DMEM), centrifugez (4 000 x g, 15 min, à température ambiante) 1 mL du milieu de culture pour éliminer les leptospires et appliquez le surnageant comme blanc pour mesurer le diamètre extérieur.
- Transformer la souche conjugative d’E. coli β2163, auxotrophe pour l’acide diaminopimélique (DAP), avec le plasmide pMaOri.dCas9 contenant la cassette d’ARNsg. Pour la transformation d’E. coli, utilisez soit des protocoles de choc thermique, soit l’électroporation. Inclure la transformation avec le plasmide pMaOri.dCas9 sans cassette d’ARNsg comme contrôle.
- Pour la transformation par choc thermique, mélanger l’ADN plasmidique (100 ng) avec des cellules d’E. coli chimiquement compétentes et incuber sur de la glace pendant 30 min. Effectuer un choc thermique à 42 °C pendant 90 s et le placer à nouveau sur de la glace pendant 5 min. Récupérer les cellules en ajoutant 1 mL de milieu LB, incuber à 37 °C pendant 1 h et procéder au placage.
- Pour l’électroporation, utilisez des cellules électrocompétentes mélangées à 100 ng d’ADN plasmidique. Utilisez les paramètres suivants pour l’impulsion : 1,8 kV, 100 Ω et 25 μF. Récupérez les cellules comme expliqué ci-dessus.
- Placez les cellules E. coli transformées du donneur dans un milieu gélosé LB complété par de l’acide diaminopimélique (DAP) (0,3 mM) et de la spectinomycine (40 μg/mL) pour sélectionner les plasmides.
- Pour la conjugaison, sélectionnez une colonie dans chaque boîte un jour avant le jour de la conjugaison (qui est déterminé par le suivi du D.E. des cultures de leptospires).
- Sélectionnez une colonie d’E. coli β2163 dans le fichier pMaOri.dCas9 vide et une colonie dans les plaques pMaOri.dCas9sgRNA. Laissez-les croître pendant la nuit dans 10 ml de LB plus DAP et de spectinomycine à 37 °C.
- Le lendemain, diluez les cultures saturées à 1:100 dans 10 mL de LB frais plus DAP (ne pas inclure l’antibiotique ici) jusqu’à ce que la DO420 nm soit de 0,2-0,4. Normalement, il faut 2 à 3 heures pour que E. coli atteigne ces densités.
- À l’intérieur d’une hotte de biosécurité BSL2, assemblez un appareil de filtration en plaçant un filtre à membrane à base d’esters de cellulose mélangés de 25 mm de diamètre et de 0,1 μm de diamètre sur le dessus de la base en verre. Placez un entonnoir en verre de 15 ml sur le dessus et tenez les deux pièces à l’aide de pinces à ressort. Connectez le verre à une pompe à vide et ajoutez les cultures dans l’entonnoir pour la filtration.
- Ajouter 5 ml de culture de Leptospira dans l’entonnoir. Ajouter un volume d’E. coli pour constituer la proportion de 1:1 basée sur les valeurs OD420nm des deux cultures. Allumez la pompe à vide et concentrez les cellules par filtration. Après la concentration des cellules dans le filtre à membrane, récupérez-la soigneusement. Assurez-vous que le fluide est filtré à travers la membrane.
note: La filtration dure 5 à 10 min.
- Placez le filtre sur une plaque EMJH disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) complétée par un DAP (0,3 mM). Assurez-vous que le côté des bactéries est vers le haut. Incuber les plaques à 29 °C pendant 24 h
note: Si l’on utilise du HAN ou des plaques EMJH internes supplémentées, E. coli peut proliférer et dépasser la proportion prévue de 1:1, ce qui peut à son tour diminuer l’efficacité de la conjugaison.
- Après 24 h, récupérez les filtres des plaques et placez chaque filtre individuel dans un tube conique de 50 ml.
- Utilisez 1 mL de milieu HAN liquide pour libérer les cellules de la surface du filtre par pipetage et vortex extensifs.
- Visualisez les solutions bactériennes mixtes récupérées par microscopie à fond noir pour vérifier la viabilité et la motilité cellulaires, ainsi que les proportions de Leptospira :E. coli.
note: À ce stade, un nombre équivalent d’E. coli et de Leptospira peut être observé.
- Étaler 100 à 200 μL de cette culture sur des plaques HAN contenant 0,4 % de sérum de lapin inactivé et 40 μg/mL de spectinomycine. Incuber les plaques à 37 °C dans une atmosphère à 3 % de CO2.
forte>REMARQUE : Normalement, les cellules sérovares de L. interrogans Fiocruz L1-130 forment des colonies en 5 à 7 jours sur des plaques témoins et en 8 à 10 jours sur des plaques de spectinomycine. À ce stade, E. coli ne se développera pas car ils sont auxotrophes pour le DAP.
- Comme témoin, diluer les cultures à 104 leptospires/mL et ajouter 100 μL sur des plaques sans antibiotique, pour surveiller la croissance des leptospires.