Silençage génique basé sur la transfection inverse siRNA in vitro : une procédure pour délivrer de petits ARN interférents dans des cellules cultivées afin d’inactiver l’expression du gène cible

Résumé

Source : Jager, J. et al.Un modèle de culture cellulaire adipocytaire pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction adipocytaire. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure permettant d’effectuer une transfection inverse de siRNA en adipocytes afin de moduler l’expression d’une protéine cible.

Protocole

1. Préparation des plaques pré-enduites

1. La veille ou quelques heures avant la transfection, préparer une solution de collagène de type I à 100 μg/mL dans de l’éthanol à 30 % à partir d’une solution mère à 1 mg/mL. Ajoutez 250 μL de collagène par puits d’une plaque à 12 puits et 125 μL par puits d’une plaque à 24 puits, et étalez la solution sur la surface du puits.
2. Laissez la plaque sans couvercle sous le capot de culture jusqu’à ce que le collagène sèche. Laver deux fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco.
   REMARQUE : Des plaques pré-enduites sont disponibles à l’achat.

2. Préparation du mélange de transfection

REMARQUE : La concentration finale de siRNA est comprise entre 1 et 100 nM (1 à 100 pmol de siRNA par puits d’une plaque de 12 puits). La concentration finale de l’imitation miR est de 10 nM (10 pmol/puits). Déterminez la meilleure concentration de chaque siRNA, miR mimic ou autre oligonucléotide avant de commencer l’expérience pour éviter les effets hors cible. Effectuer des expériences de transfection en trois exemplaires pour faciliter l’analyse statistique des résultats. Préparez tous les réactifs en excès pour tenir compte des pertes normales pendant le pipetage.

1. Mélanger par pipetage (volume/volume) le siRNA (ou d’autres oligonucléotides) avec un Minimal Essential Medium amélioré (Tableau 1). Incuber 5 min à température ambiante.
2. Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNi et à la pipette pour mélanger (Tableau 1). Incuber pendant 20 min à température ambiante (pendant ce temps, passer à la section 3). Ajoutez le mélange de transfection dans chaque puits de la plaque recouverte de collagène.

3. Préparation des adipocytes 3T3-L1

1. Lavez deux fois les cellules de la boîte de Pétri de 100 mm avec du D-PBS. Ajoutez 5 fois la trypsine dans les cellules (1 mL par parabole de 100 mm), en prenant soin de couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 s et retirez délicatement la trypsine.
2. Incuber la boîte de Pétri pendant 5 à 10 minutes à 37 °C dans l’incubateur. Tapotez la parabole de 100 mm pour détacher les cellules.
3. Ajoutez 10 ml de DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine pour neutraliser la trypsine. Pipetez soigneusement le fluide de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire.
4. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur de cellules automatisé, et ajustez la concentration des cellules à 6,25 x 10⁵ cellules/mL de milieu. Graine 800 μL de la suspension cellulaire/puits d’une plaque à 12 puits (5 x 10⁵ cellules) ou 400 μl de la suspension cellulaire/puits d’une plaque à 24 puits (2,5 x 10⁵ cellules) contenant le mélange de transfection.
   note: Une boîte de Pétri de 100 mm d’adipocytes permettra de préparer une plaque de 12 puits ou une plaque de 24 puits. Une boîte de 100 mm contient généralement 6-7 x 10⁶ adipocytes, ce qui correspond à 5 x 10⁵ adipocytes par puits d’une plaque à 12 puits.
5. Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire (7 % de CO2 et 37 °C), et ne pas déranger les cellules pendant 24 h. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine.
   REMARQUE : Il est également possible d’ensemencer les cellules dans des plaques de 48 et 96 puits pré-enrobées de collagène, mais prenez plus de précautions lors du remplacement du milieu pour éviter le détachement des adipocytes.

	Par puits (plaque à 12 puits)	Par puits (plaque de 24 puits)
Oligonucléotides	20 μL	10 μL
(ARN-si, miR...)
Média essentiel minimal amélioré	20 μL	10 μL
Réactif de transfection	5,6 μL	2,8 μL
Média essentiel minimal amélioré	154,4 μL	77,2 μL
Volume total du mélange de transfection	200 μL	100 μL

Tableau 1 : Réactifs de transfection requis pour les formats de plaque à 12 et 24 puits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture tissulaire à 12 puits	Dutscher	353043
2,5 % de trypsine (10x)	Gibco	Référence 15090-046	Dilué à 5x avec D-PBS
2-Propanol	sigma	I9516
3-Isobutyl-1-méthylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Albumine sérique bovine (BSA)	sigma	A7030
Collagène de type I de peau de veau	Sigma-Aldrich	Réf. C8919
dexaméthasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Milieu modifié des aigles de Dulbecco (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 g/L de D-glucose ; L-Glutamine ; pas de pyruvate
éthanol	sigma	Référence 51976
mimimes de micro-ARN	Horizon Découverte
SiRNA témoin négatif marqué FAM	Invitrogen	AM4620
Sérum pour veau nouveau-né	Gibco	Référence 16010-159
Sérum fœtal bovin	Gibco	Référence 10270-106
Pénicilline et streptomycine	Gibco	Référence 15140-122
SiRNA témoin négatif marqué FAM	Invitrogen	AM4620
ON-TARGETplus Souris Plin1 siRNA SMARTpool	Horizon Découverte	L-056623-01-0005
Réactif de glycérol libre	Sigma-Aldrich	F6428
Boîte de Pétri 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
Réactif de transfection (INTERFERin)	Polyplus	N° 409-10
Média essentiel minimal amélioré (Opti-MEM)	Gibco	Référence 31985-047
Insuline humaine recombinante	Gibco	Référence 12585-014