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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Transfection du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI) dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires
- Isolez les cellules épithéliales alvéolaires de type II des poumons de rat.
- Ensemencer les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/cm2 dans des boîtes de Pétri de 100 mm avec un milieu essentiel minimum complet (MEM complet). Le MEM complet est complété par 10 % de FBS, 0,08 mg/L de tobramycine, Septra (3 μg/mL de triméthoprime et 17 μg/mL de sulfaméthoxazole), 0,2 % de NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) et 2 mM de L-glutamine. Cultivez les cellules pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
- Le lendemain, placez 500 μL de MEM complet sans antibiotique dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 12 puits et préchauffez la plaque à 37 °C pendant 30 min. Au cours de cette étape, il est important d’utiliser du sérum fœtal de bovin exempt de tétracyclines contaminantes ou dont le niveau est trop faible pour interférer avec l’inducilibilité.
- Préparez des tubes de 1,5 mL contenant le plasmide avec le GOI inductible (plasmide GOI) et le vecteur régulateur (p. ex., pTet-Off) en ajoutant 1 μg de plasmide GOI et 1 μg de vecteur régulateur par puits à RT. Pour les expériences de coexpression avec des protéines de liaison à l’ARN (RBP), 1 μg d’un vecteur constitutif (par exemple, pcDNA3) exprimant le RPB d’intérêt est ajouté au mélange d’ADN (Figure 4).
- Aspirez le milieu et rincez doucement les cellules avec du PBS (sans calcium ni magnésium) préchauffé à 37 °C.
- Ajouter 5 mL de trypsine à 0,05 % préchauffée à 37 °C et incuber les cellules jusqu’à ce qu’elles se détachent (2 à 4 min). Neutralisez la trypsine en ajoutant 10 mL de MEM complet sans antibiotique.
- Prélever la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml, laver la boîte de Pétri avec 4 ml de milieu pour recueillir autant de cellules restantes que possible, puis centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.
- Aspirez et jetez doucement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de PBS. Comptez et calculez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer doucement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un tampon de remise en suspension à une concentration de 4 x 107 cellules/mL. Ajoutez les cellules du tube de 1,5 mL préparé à l’étape 2.4 à une concentration de 400 000 cellules par puits et mélangez-les doucement en pipetant de haut en bas.
- Placez le tube dans le dispositif d’électroporation et remplissez-le de 3,5 ml de tampon électrolytique.
- Insérez une pointe d’électrode plaquée or dans une pipette en appuyant complètement sur le piston. Mélangez délicatement le contenu du tube de 1,5 ml et aspirez soigneusement les cellules avec la pipette. Veillez à ce que des bulles d’air ne pénètrent dans la pointe, car cela provoquera des arcs électriques pendant l’électroporation et entraînera une diminution de l’efficacité de la transfection.
- Insérez la pipette dans la station d’électroporation jusqu’à ce qu’il y ait un clic.
- Sélectionnez le protocole d’électroporation approprié pour les cellules épithéliales alvéolaires, correspondant à une tension d’impulsion de 1 450 V et à 2 impulsions d’une largeur de 20 ms, et appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile.
- Immédiatement après la transfection, retirez la pipette et transférez les cellules dans un puits préalablement rempli de MEM complet sans antibiotique qui a été préchauffé à 37 °C.
- Répétez les étapes 1.11 à 1.14 pour les échantillons restants.
- Secouez doucement la plaque pour répartir les cellules uniformément sur la surface du puits. Incuber les cellules à 37 °C dans 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Après 2 jours, remplacez le milieu par du MEM complet avec des antibiotiques.
- Confirmer le succès de la transfection en observant l’expression de l’eGFP au microscope à fluorescence ou par cytométrie en flux à l’aide d’un vecteur témoin (Figure 1).
note: Cette étape est facultative et nécessite une étape de transfection supplémentaire à l’aide d’un plasmide différent exprimant l’eGFP, tel que pcDNA3-EGFP.
2. Induction de l’inhibition de la transcription du GOI
REMARQUE : Les cellules peuvent être prétraitées avec les traitements souhaités avant l’induction de la doxycycline afin d’évaluer leur impact sur la stabilité de l’ARNm (Figure 3).
- Préparez une solution mère de doxycycline de 1 mg/mL dans de l’eau désionisée. Conservez la solution mère à -20 °C à l’abri de la lumière. La doxycycline, un dérivé de la tétracycline, est utilisée à la place de la tétracycline car elle a une demi-vie plus longue (2x) que la tétracycline. De plus, une concentration plus faible de doxycycline est nécessaire pour l’inactivation complète de l’opéron tet.
note: La doxycycline pourrait affecter l’expression de l’ARNm du GOI endogène. Pour vérifier cela, l’effet d’un traitement de 24 heures à la doxycycline sur les cellules alvéolaires doit être testé pour confirmer l’absence de tout changement dans l’expression de GOI (Figure 2).
- Préparez une solution fraîche de 1 μg/mL de doxycycline dans du MEM complet 72 h après la transfection et réchauffez-la à 37 °C.
- Remplacer le milieu par 1 mL de MEM complet contenant 1 μg/mL de doxycycline par puits pour inhiber la transcription de l’IG.
- Incuber plusieurs puits à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant différentes durées de 15 min à 6 h pour évaluer la demi-vie de l’ARNm du GOI.
- À la fin du traitement, lavez les cellules avec du PBS glacé et lysez-les avec un kit d’extraction d’ARN phénol-chloroforme disponible dans le commerce en ajoutant 500 μL de tampon par puits et en secouant la plaque pour homogénéiser les cellules.
- Isolez l'ARN selon le protocole du fabricant. Déterminez le rendement et la pureté de l’ARN par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nm. Les échantillons d’ARN avec des rapports de 260:230 et 260:280 de 1,8 et 2,0, respectivement, sont considérés comme purs.
note: Le protocole peut être mis en pause ici.
