Transformation génique basée sur un vecteur chromosomique artificiel bactérien binaire chez les plantes Arabidopsis : une technique pour générer des plantes transgéniques avec insertion en une seule copie

Abstract

Source : Tark-Dame, M., et al. Génération de plantes transgéniques avec des insertions en une seule copie à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW. J. Vis. Exp. (2018).

Dans cette vidéo, nous démontrons la génération de plantes transgéniques Arabidopsis exprimant un transgène stable par transformation génique artificielle bactérienne binaire basée sur des chromosomes par Agrobacterium.

Protocol

1. Arabidopsis Transformation

1. Préparez les plantes d’Arabidopsis pour la transformation.
   1. Cultivez les plantes d’Arabidopsis dans une serre ou une chambre de culture climatisée jusqu’à ce qu’elles fleurissent (12 pots de 9 plantes chacun par trempage).
   2. Clipsez les premiers boulons pour permettre à d’autres boulons secondaires de sortir. Les plantes sont prêtes à tremper 4 à 6 jours après la coupe, lorsque les plantes ont de nombreux capitules immatures et peu de siliques fertilisés.
2. Trempette florale
   1. Tremper les inflorescences pendant 5 à 10 secondes dans une suspension d’Agrobacterium portant de l’ADN-T cloné avec un chromosome artificiel bactérien binaire ou BIBAC. Utilisez une agitation douce.
   2. Enveloppez les parties aériennes des plantes dans du film alimentaire pour maintenir l’humidité élevée et couvrez les pots de fleurs avec une boîte pour garder les plantes dans l’obscurité. Incuber les plantes pendant 2 jours dans une serre/chambre de croissance.
   3. Retirez la boîte et le film alimentaire et faites pousser les plantes jusqu’à maturité dans une serre/chambre de croissance.
      note: Pour augmenter l’efficacité de la transformation, les mêmes plantes peuvent être re-trempées 7 jours après le premier trempage.
   4. Récoltez les graines. Regrouper et analyser les graines (T1) de plantes, transformées avec la même construction, comme un seul ensemble.
3. Dépister les plantes transgéniques.
   1. Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé de pBIBAC-RFP-GW, analysez les graines à l’aide de la microscopie à fluorescence. Afin de détecter l’expression de DsRed dans les témentages, imagez les graines à une excitation de 560 nm et une émission de 600 à 650 nm. Séparez les graines fluorescentes de leurs homologues non fluorescentes à l’aide d’une pince.
   2. Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé de pBIBAC-BAR-GW, semez les graines dans des plateaux remplis de terre (~2 500 graines/0,1 m²). Pour assurer une répartition uniforme des graines sur les plateaux, suspendre les graines dans de la gélose à 0,1 % dans un milieu Murashige Skoog (MS) 0,5x et étaler les graines à l’aide d’une pipette de 1 ml.
      note: Pour stimuler la germination des graines de manière synchrone, incubez les graines pendant au moins 2 jours à 4 °C. Cela peut être fait avant ou après le semis des graines.
      1. Vaporisez les plantules avec une solution de glufosinate-ammonium à 0,5 % 2 semaines et 3 semaines après le semis en plateaux. Utiliser 500 mL de solution de glufosinate-ammonium par 1^m2.
      2. Transférez les semis survivants dans des pots individuels. La figure 1 montre une image typique d’un plateau avec des semis avant et après le (deuxième) traitement au glufosinate-ammonium.
      3. Analyser les plantes résistantes au glufosinate-ammonium par PCR pour la présence de la construction d’intérêt.
         1. Isolez l’ADN génomique de la plante pour la PCR.

Results

Figure 1 : Plateau rempli de semis d’Arabidopsis avant et après le traitement au glufosinate-ammonium. Les plantules qui n’expriment pas le gène bar présent dans l’adn-t pBIBAC-BAR-GW meurent après avoir été pulvérisées avec une solution de glufosinate-ammonium. Les photos montrent le même plateau de semis (A) avant la pulvérisation de glufosinate-ammonium, 14 jours après le semis, et...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulfate de kanamycine monohydraté	Duchefa	K0126
Mélange d’enzymes clonases Gateway LR	Thermo Scientific - Invitrogen	Référence 11791-019
Murashige Skoog moyen	Duchefa	Référence M0221
agar-agar	Bd	Référence 214010
Glufosinate-ammonium (Basta)	Bayer	79391781
Imageur au phosphore	GE Healthcare Sciences de la vie	Typhon FLA 7000
film alimentaire (Saran wrap)	Omnilabo	1090681
Agarose	Thermo Scientific - Invitrogen	N° 16500