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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Conception de l’oligo morpholino
REMARQUE : Les séquences d’A. mexicanus sont disponibles via le gène du National Center of Biotechnology Information (NCBI) et le NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), ainsi que dans le navigateur de génome Ensembl (https://www.ensembl.org). Lors de la conception d’un morpholino pour une utilisation à la fois dans les formes de surface et dans les grottes, il est essentiel d’identifier toute variation génétique entre les morphes à ce stade, afin que ces régions génétiques puissent être évitées en tant que cibles pour les morpholinos. Toute variation polymorphe au sein d’un site cible morpholino peut conduire à une liaison inefficace. La conception est similaire à celle d’autres systèmes de poissons, tels que le poisson-zèbre, et s’est déjà avérée efficace chez A. mexicanus.
- Conception de morpholinos
bloquant la traduction
note: Les morpholinos bloquant la traduction bloquent la traduction en se liant au site de départ endogène et empêchent la machinerie traductionnelle de se lier à la séquence d’ARNm par une entrave stérique.
1. Identifiez la région codante du gène cible en commençant par l’ATG start site.
2. Enregistrez les 25 premières paires de bases de la séquence cible en copiant et collant la séquence dans un éditeur de texte ou un cahier de laboratoire.
3. À l’aide d’un logiciel en ligne (p. ex., http://reverse-complement.com) ou d’une traduction manuelle, générez le complément inverse de la séquence cible. Enregistrez le complément inverse obtenu dans un éditeur de texte ou un cahier de laboratoire.
4. Commandez un morpholino avec la séquence inverse du complément auprès d’une entreprise qui génère des oligonucléotides morpholino. Voir le tableau des matériaux pour les entreprises.
2. Microinjections
- Préparation des outils généraux pour les injections
note: Les procédures décrites dans cette section ont été décrites en détail ailleurs, et un aperçu avec des modifications mineures est présenté ici.
- Générez des plaques d’injection en versant de l’agarose chaude à 3 % dissoute dans l’eau du système de poisson dans une boîte de Pétri de 100 ml. Placez soigneusement un moule d’injection d’œufs dans l’agarose fraîchement versée pour faire des puits pour les œufs de poisson. Placez le côté du moule dans la gélose à un angle de 45° puis abaissez-le lentement dans l’agarose ; Abaisser lentement le moule à un angle évite que l’air ne soit emprisonné sous le moule. Retirez délicatement le moule une fois l’agarose solidifiée. Les plaques peuvent être stockées, scellées, à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
- Collecte d’ovules au stade unicellulaire
- La nuit où la reproduction est prévue, examinez les bassins toutes les 15 à 30 minutes et surveillez la présence d’œufs au fond du bassin. Les œufs semblent translucides, mesurant environ 1 mm de diamètre.
- Utilisez un filet de pêche à mailles fines pour recueillir les œufs et les transférer dans un bol en verre rempli d’eau fraîche du système de poisson. Examinez les œufs au microscope pour confirmer qu’ils sont au stade unicellulaire.
- À l’aide de pipettes en verre, transférez les œufs unicellulaires dans les plaques d’injection. Des pipettes en verre sont nécessaires à ce stade car les œufs collent au plastique.
- À l’aide d’une pipette, libérez délicatement les œufs dans les puits de la plaque d’injection d’agarose de la section 2.1. Remplissez les rangées de la plaque d’injection préchauffée (à température ambiante) avec le nombre maximum d’œufs (30 à 40 par rangée, et jusqu’à cinq rangées). Des rangées pleines aident à empêcher les œufs de bouger pendant les injections. Gardez les œufs hydratés sur la plaque d’injection avec une petite quantité d’eau du système de poisson jusqu’à la performance des injections.
- Configuration de la pico-injection et directives générales d’optimisation de l’injection
- Remplissez les aiguilles d’injection à l’aide d’embouts de pipette à chargement de gel qui s’insèrent à l’intérieur du capillaire ou à l’aide d’embouts de micropipette standard et en ajoutant un bolus de 2 à 4 μL à l’extrémité. Une fois l’aiguille remplie, utilisez une pince pour couper l’excès de longueur de l’aiguille d’injection.
- Effectuer des micro-injections à l’aide d’une aiguille montée dans un micromanipulateur, reliée à un micro-injecteur de picolitres.
- Réglez le temps d’injection à 0,03 s et la pression sortante à ~0,0 psi. La pression d’injection variera en conséquence avec des différences mineures entre les aiguilles, alors optimisez pour obtenir un bolus d’injection de ~1,0 nL.
note: La pression d’injection est souvent de l’ordre de ~10 à 30 psi.
- Normalisez le bolus d’injection en l’injectant dans de l’huile minérale et en mesurant la taille du bolus avec un micromètre à glissière pour obtenir un volume d’injection de ~1 à 1,5 nL. Ajustez la pression d’injection (psi) pour augmenter ou diminuer le volume du bolus.
- Prélevez l’eau du haut des œufs à l’aide d’un mouchoir en papier.
note: Le chorion de l’œuf d’Astyanax est légèrement plus difficile à pénétrer que les œufs de poisson-zèbre. Nous constatons que le fait d’aspirer l’eau du haut des œufs facilite la pénétration de l’aiguille dans l’œuf. L’optimisation de l’assiette peut permettre d’obtenir ~200 œufs sur une seule assiette.
- À l’aide du micromanipulateur, pénétrez chaque œuf avec l’aiguille et injectez-le directement dans le jaune. Une fois positionné dans le jaune, injectez l’œuf en appuyant sur le bouton d’injection ou la pédale d’injection.
note: Une plaque complète peut être injectée en ~15 min. L’étape unicellulaire dure ~40 min.
- Injection de morpholinos
note: La quantité de morpholino nécessaire pour inactiver sans provoquer de toxicité devra être optimisée par cible génique ; Cependant, une concentration de 400 pg est un bon point de départ.
- Préparez le morpholino de manière à ce que 400 pg de morpholino soient injectés par œuf. Décongeler le morpholino sur de la glace. La solution injectable est composée de morpholino (à la concentration souhaitée), de H2O sans RNase ou de solution de Danieau, et de rouge de phénol (10 % du volume final). Pour un exemple, voir le tableau 1.
- Injecter 1 nL par embryon.