Transgenèse du poisson-zèbre par transposon Tol2 : une procédure pour générer un poisson-zèbre transgénique suite à la co-injection du système Tol2 dans des embryons de poisson-zèbre fécondés

Résumé

Source : Silic, M. R., et al. Visualisation de l’activité électrique cellulaire chez les embryons précoces et les tumeurs du poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous démontrons une procédure pour générer une lignée transgénique stable de poisson-zèbre exprimant constitutivement une protéine indicatrice de tension fluorescente suite à la co-injection du système de transposon Tol2 comprenant l’ARNm de la transposase et la construction du transposon Tol2 codant pour l’indicateur de tension fluorescente.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Microinjection

1. Mettre en place 4 à 6 bassins d’élevage avec au moins 2 mâles et 2 femelles l’après-midi avant l’injection. Ces poissons ne doivent pas être nourris l’après-midi. Cette étape réduira la quantité de déchets de poissons et permettra de gagner du temps pour les nettoyer le lendemain matin, tout en aidant à induire une réponse de reproduction.
2. Le lendemain matin, retirer de la congélation à -80 °C la solution injectable préparée comprenant : (i) un transposon Tol2 contenant un promoteur d’ubiquitine de poisson-zèbre et le gène indicateur de tension fluorescente ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), et (ii) de l’ARNm Tol2, et la placer sur de la glace.
3. Tirez les séparateurs dans les aquariums d’élevage de poissons et laissez les poissons s’accoupler. En général, les poissons pondent des œufs dans les 20 à 30 minutes suivant le retrait du séparateur. Sinon, attendez 1 à 2 heures de plus. Certains poissons peuvent ne pas pondre d’œufs du tout. Dans ce cas, répétez cette expérience pour la collecte d’embryons de poisson.
4. Pendant l’attente, assurez-vous qu’il y a des aiguilles préparées avec la pointe cassée à un angle créant un bord biseauté avec une pince, ou en cassant sur un essuie-glace délicat.
   1. Tirez les aiguilles du verre capillaire sur un extracteur de micropipette en utilisant les paramètres suivants : chaleur 545 ; traction 60 ; vitesse 80 ; temps 250 ; pression 500. Cassez l’aiguille avec une pince sous une lunette de dissection (avec une règle oculaire pour l’estimation du diamètre) en tenant la pince à un angle d’environ 45°. Le diamètre de l’aiguille souhaité peut varier en fonction des réglages du micro-injecteur, mais un diamètre plus petit est préférable pour réduire la mortalité embryonnaire.
5. Une fois que les poissons ont pondu des œufs, collectez-les dans une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre et apportez-les à la portée de dissection. Retirez tous les embryons anormaux et les déchets de poisson.
6. Pipetez les embryons fécondés dans le moule d’injection d’agarose à 3 % préparé. Retirez l’excès d’eau pour aider à maintenir les embryons en place.
7. Une fois que toutes les rangées sont remplies d’embryons viables, disposez-les de manière à ce que les cellules individuelles soient toutes orientées dans la même direction vers l’aiguille, qui est d’environ un angle horizontal d’environ 45°. Cela rendra l’injection beaucoup plus facile plus tard.
8. Tout en portant des gants, utilisez une pointe de pipette de chargement de 20 μL et retirez 5 μL de la construction préparée du tube sur de la glace.
9. Insérez soigneusement l’embout dans l’extrémité arrière du tube capillaire cassé jusqu’à l’endroit où il commence à s’effiler, de manière à rapprocher le réactif de l’embout. S’il y a encore des bulles d’air, secouez l’aiguille en veillant à ne pas casser la pointe.
10. Insérez l’aiguille directement dans le porte-aiguille de micro-injection et serrez soigneusement jusqu’à ce que l’aiguille reste en place. Ajustez l’angle à environ 45°.
11. Une fois l’aiguille préparée et fixée, allumez le microscope et le réservoir de gaz sous pression. Les réservoirs commerciaux de CO₂ sont généralement bons à cet effet. Le volume d’injection est ajusté en fonction de la pression de maintien et d’éjection : environ 0,5 psi pour le maintien et 30 psi pour l’éjection. Assurez-vous de vérifier que la solution sort en appuyant sur la pédale.
12. À l’aide d’un micromètre à étages avec une goutte d’huile minérale, ajustez le volume et le débit de la solution à ~150 μm de diamètre (environ 2 nL). Assurez-vous que la contre-pression laissera une petite quantité s’écouler de l’aiguille. S’il n’y a pas assez de contre-pression, l’action capillaire fera pénétrer du liquide dans l’aiguille et détruira l’ARNm.
13. Une fois l’aiguille calibrée, commencez à injecter la construction dans la cellule unique des embryons fécondés.
    note: Cela demande beaucoup de pratique, de patience et de finesse, car la membrane cellulaire est difficile à percer. Il est important d’injecter la solution dans la cellule, et non le jaune, pour générer du poisson-zèbre transgénique. Ceci est différent de l’injection de morpholino. Peu importe de quel côté l’aiguille entre dans la cellule, tant que la construction va dans la cellule. La transgenèse aura un très faible taux de succès si elle est injectée dans le jaune d’œuf plutôt que dans la cellule. L’injection en phase unique est également importante, sinon des poissons chimères somatiques seront créés. Cela réduira le risque que le transgène pénètre dans les cellules germinales.
14. Utilisez le bord de l’encoche du gel pour fournir un support qui maintient l’embryon en place et permet à l’aiguille d’appliquer une pression sans déplacer l’embryon. Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la cellule unique, appuyez sur la pédale pour libérer la quantité souhaitée de solution. Répétez ce processus pour tous les embryons.
15. Une fois terminé, transférez les embryons injectés dans un plat étiqueté en les rinçant de l’encoche d’agarose avec de l’eau du système de poisson et une pipette de transfert jetable de 3,4 mL. Conservez les embryons dans un incubateur à 28,5 °C pour les laisser se développer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Pour la fabrication des gels d’injection
Lunette de dissection en fond clair	Nikon	SMZ 745	Déchorionnation, microinjection, montage
Pipette de transfert jetable 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9 h	Embryons de poissons et transfert d’eau
Pince #5	WPI	500342	Déchorionnation et rupture d’aiguille
Astuce de chargement	Eppendorf	930001007	Pour le chargement de la solution d’injection dans les aiguilles capilaires
Moule de micro-injection	Outils de science adaptative	TU-1	Pour préparer un plateau de moule d’agaorse pour contenir les embryons de poisson pendant l’injection
Micro-injecteur	WPI	Picopompe pneumatique PV820	Injecteur de micro-injection
Micro-manipulateur	WPI	Micro-injecteur MM3301R	Opération de micro-injection
Extracteur de micropipette	Instrument de sutter	P-1000	Pour la préparation de l’aiguille capillaire
huile minérale	Amresco	J217-500ml	Pour calibrer le volume d’injection
Boîtes de Pétri en plastique	VWR	Référence 25384-088	Pour maintenir des poissons ou des embryons de poissons pendant le processus d’imagerie
Micromètre de platine	Am Scope	MR100	Calibrage du volume de micro-injection
Capillaires en verre à paroi mince	WPI	TW100F-4	Verre brut pour la fabrication d’aiguilles cappilaires